RAGE抗體對大鼠膽道梗阻性肝損傷的抑制作用及其機理研究.pdf

1、近年來，由膽道梗阻性肝損傷引起的急性肝損傷和肝纖維化/肝硬化患者日趨增多，嚴重威脅著人類健康。本文從制備高活性高純度低內毒素的重組小鼠G-CSF蛋白及重組大鼠sRAGE蛋白入手，經免疫新西蘭大白兔及利用抗原親和純化，制備具有高特異性的兔抗大鼠 RAGE多克隆抗體，以此作為治療膽道梗阻性肝損傷新蛋白藥物的原料，然后采用膽道梗阻性肝損傷動物模型--大鼠膽管結扎(BDL)模型，研究其藥效，并從基因角度探究其作用機理，旨在為探索和研究治療膽道梗

2、阻性肝損傷的新藥物提供科學依據。主要研究結果如下：
　　1、選擇小鼠G-CSF（mG-CSF）和大鼠sRAGE（rsRAGE）兩個蛋白作為候選藥物并進行表達純化。構建了 pET-30a(+)-mG-CSF表達質粒并利用大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）表達系統(tǒng)獲得了高純度、低內毒素和高生物學活性的G-CSF蛋白，并且發(fā)現重組小鼠G-CSF蛋白對肝纖維化的治療并無顯著效果。
　　2、構建了 rsRAG

3、E-pPICZαA表達質粒并利用畢赤酵母（Pichia pastoris，P. pastoris）表達系統(tǒng)獲得了高產量、高純度、低內毒素和高生物學活性的重組大鼠sRAGE蛋白。研究還揭示了重組大鼠sRAGE蛋白可顯著降低CCl4導致的大鼠肝纖維化。
　　3、通過免疫新西蘭大白兔及純化獲取了具有高特異性的兔抗大鼠 RAGE多克隆抗體，同時應用大鼠膽管結扎模型，研究了 RAGE抗體在膽道梗阻性肝損傷的作用。結果顯示 RAGE抗體可顯著

4、改善大鼠生長和生存狀況；同時在對肝臟組織的H&E和MASSON染色中發(fā)現該抗體可顯著降低膽阻性的肝壞死，炎癥，纖維化和膽管增生。血清學指標也發(fā)現 RAGE抗體可顯著改善膽阻引起的肝功能損傷和肝纖維化。
　　4、通過體內體外實驗，初步探索了RAGE抗體在膽道梗阻性肝損傷中的作用機理。在體內實驗中，采用免疫組化和熒光定量技術發(fā)現 RAGE抗體可顯著抑制炎癥因子 IL-1β的轉錄水平以及其在損傷部位的表達，從而降低肝臟壞死/炎癥；RAG

5、E抗體可顯著地調節(jié)MMPs/TIMP-1的表達水平，降低肝纖維化；RAGE抗體還可顯著地調節(jié)Cyp7α1的表達水平，以降低膽管增生。通過體外LX-2肝星狀細胞系實驗，證實了RAGE抗體可顯著降低Col1α1和MMP-9的表達水平。最后，體內和體外實驗同時證實了RAGE抗體可顯著降低肝星狀細胞的活力。
　　綜上研究表明，通過檢測和分析各類肝硬化相關基因的表達變化，RAGE抗體對膽道梗阻性肝損傷具有明顯的保護作用；同時，體外肝星狀細胞