第三方骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)同種異體移植受體免疫耐受機(jī)制的研究.pdf

1、目的:通過對第三方骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,BMSCs)注射同種異體皮片移植小鼠受體的研究,驗證BMSCs具有延長受體小鼠皮片存活的作用,并初步研究其MSCs誘導(dǎo)同種異體免疫耐受的作用機(jī)制。
　　 方法:1BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定:無菌條件下取SD大鼠股骨,制成骨髓單細(xì)胞懸液。采用全骨髓培養(yǎng)法,接種于含有10％FBS的DMEM的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),間隔3d除去非

2、貼壁細(xì)胞,待細(xì)胞鋪滿至瓶底達(dá)90％時傳代,取第3代以后的細(xì)胞,調(diào)整濃度為2×106/ml備用。流式細(xì)胞儀鑒定SD大鼠MSCs表面抗原CD29、CD34、CD45和CD90。2動物模型的建立:40只雌性C57BL/6小鼠作為供體,麻醉后于其軀干部以鉗夾法制成一約1cm2的圓形皮片;40只雄性BALB/C小鼠作為受體,剪去全層皮膚一塊,形成約1cm2的圓形創(chuàng)面,建立穩(wěn)定的同種異體皮膚移植模型。3細(xì)胞,藥物輸注與實驗分組:將40只BALB/C

3、小鼠隨機(jī)分為4組:①空白對照組:只進(jìn)行皮膚移植,未給予其他治療;②環(huán)磷酰胺組(CP組):大劑量環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CP)腹腔注射,200mg/kg,連用2d(q.d.);③單純給予SD-BMSCs移植組(SD-BMSCs組):移植當(dāng)天自受體小鼠尾靜脈輸注2×106個SD-BMSCs;④細(xì)胞藥物聯(lián)合運用組(CP+SD-BMSCs組):大劑量環(huán)磷酰胺組(Cyclophosphamide,CP)腹腔注射,200mg/k

4、g,連用2d(q.d.),并于移植當(dāng)天自受體小鼠尾靜脈輸注2×106個SD-BMSCs。4移植皮片的大體觀察與HE染色:術(shù)后第7天觀察受體小鼠移植的皮片,并記錄存活時間。皮片90％結(jié)痂為壞死,若皮片完全變黑、發(fā)硬、脫落視為排斥,進(jìn)行病理分級;并取每組受體小鼠移植皮片進(jìn)行HE染色觀察。5受體小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+、CD25+、Foxp3+、Treg細(xì)胞)的檢測:取移植術(shù)后第7天受體小鼠脾制備單細(xì)胞懸液,用CD4、CD25、Foxp

5、3熒光標(biāo)記抗體檢測移植后Treg細(xì)胞的含量。6受體小鼠外周血細(xì)胞因子(TGF-β、IL-10、IFN-γ)的檢測:取移植術(shù)后第7天受體小鼠外周血進(jìn)行TGF-β、IL-10、IFN-γ細(xì)胞因子ELISA檢測。7不同來源異基因MSCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖的情況檢測:異基因T淋巴細(xì)胞(來源于C57小鼠或SD大鼠)與經(jīng)60Co照射的不用來源MSCs共培養(yǎng)后,MTT法測定異基因T淋巴細(xì)胞增殖的情況。
　　 結(jié)果:1SD-BMSCs的培養(yǎng)觀察

6、與鑒定:全貼壁原代培養(yǎng)的BMSCs_48h后可見有細(xì)胞貼壁生長,部分形態(tài)變?yōu)樗髽?之后細(xì)胞迅速增長,至7～11d時細(xì)胞已增殖至90％融合,呈漩渦狀生長。傳代細(xì)胞24h貼壁,5～7_d傳一代,可穩(wěn)定傳代至少20次;流式細(xì)胞儀鑒定經(jīng)培養(yǎng)的MSCs的結(jié)果為:間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD44陽性率分別為99.7％和96.7％;造血系干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34,CD45陽性率分別為1.6％和1.3％。2移植皮片的存活時間與HE染色結(jié)果:CP+S

7、D-MSCs組皮膚移植物存活時間為(15.7±1.4)d,空白對照組為(6.1±1.1)d,CP組為(12.3±1.5)d,SD-BMSCs組為(12.6±1.8)d,CP+SD-BMSCs組皮膚移植物存活時間明顯比后3組延長(P＜0.05);對照組表現(xiàn)為表皮與真皮層完全壞死,細(xì)胞數(shù)量明顯增加,炎癥反應(yīng)明顯。藥物組和細(xì)胞組可見真皮細(xì)胞減少,并呈現(xiàn)廣泛纖維化。藥物和細(xì)胞組可見部分表皮缺失,真皮層正常,并可見毛囊結(jié)構(gòu)。3受體小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T

8、細(xì)胞(CD4+、CD25+、Foxp3+、Treg細(xì)胞)的檢測結(jié)果:流式細(xì)胞儀檢測Treg含量SD-BMSCs組和CP+SD-BMSCs組明顯高于空白對照組和CP組(P＜0.05).4受體小鼠外周血細(xì)胞因子(TGF-β、IL-10、IFN-γ)的檢測結(jié)果:ELISA檢測受體外周血MSCs組和CP組TGF-β和IL-10明顯高于空白對照組,SD-BMSCs和CP組IFN-γ則明顯低于空白對照組(P＜0.05).5不同來源MSCs刺激異基因

9、T淋巴細(xì)胞增殖的情況檢測:共培養(yǎng)結(jié)果顯示:來源于C57小鼠和SD大鼠的MSCs可以明顯抑制T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)(P＜0.05),而上述兩組組間比較差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)
　　 結(jié)論:1第三方MSCs能夠延長同種異體皮片移植物的存活時間.2第三方MSCs誘導(dǎo)同種異體移植免疫耐受作用可能與誘導(dǎo)受體Treg細(xì)胞增殖有關(guān).3第三方MSCs誘導(dǎo)同種異體移植免疫耐受作用可能與促進(jìn)免疫耐受因子的表達(dá),抑制免疫排斥因子的表達(dá)有關(guān).4