甘薯塊根可溶性糖含量在生長期間的變化及IbSuSy基因和IbUGP基因的克隆.pdf

1、甘薯是世界上重要的糧食、飼料和工業(yè)原料用作物，是全球種植的主要作物之一。我國甘薯常年種植面積超過9000萬畝，占世界甘薯栽培面積的85％以上，年產(chǎn)量超過1億噸，居世界首位。面對全球能源危機和糧食危機，甘薯在發(fā)展生物質(zhì)能源和作為主要糧食重要補充中扮演著十分重要的角色，是我國首選的生物質(zhì)能源作物和主要糧食補充作物。 甘薯塊根可溶性糖含量，是重要的品質(zhì)性狀之一，其含量的高低和變化很大程度上決定了甘薯的食品品質(zhì)、加工品質(zhì)以及抗逆性。蔗糖

2、是植物可溶性糖中含量最高的一種重要的糖類，只有轉(zhuǎn)化為已糖或磷酸已糖后才能進入細胞內(nèi)參與其他代謝。而上述這一轉(zhuǎn)化過程是通過一系列的酶促反應(yīng)來實現(xiàn)的。蔗糖合成酶(Sucrose synthase，SuSy)裂解蔗糖，是蔗糖轉(zhuǎn)化為已糖或磷酸已糖這一過程中的關(guān)鍵酶。植物中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(Uridinediphosphate—gluicose Pyrophophorylase，UGP)催化淀粉糖化過程第一步反應(yīng)并合成UDPG，處于蔗糖

3、和淀粉途徑的交叉點，為淀粉、蔗糖和其他結(jié)構(gòu)多糖直接或間接地提供前體物質(zhì)。因此，研究糖代謝途徑中上述兩種關(guān)鍵酶基因有著重要的意義。 本文在研究9個甘薯專用型品種在5個生長時期中塊根可溶性糖含量的變化的基礎(chǔ)上，以含有甘薯近緣植物(Ipomoea trifida)1/8血緣的甘薯新品種“渝蘇303”為材料，對糖代謝途徑關(guān)鍵酶基因蔗糖合成酶(IbSuSy)基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(IbUGP)基因進行克隆及生物信息學分析。其結(jié)果

4、如下： 一、甘薯生長期間塊根可溶性糖含量的變化 通過對9個甘薯品種、5個生長期的雙因素試驗，甘薯品種塊根可溶性糖含量的品種效應(yīng)、生長期效應(yīng)和品種×生長期互作效應(yīng)均達到極顯著。品種間塊根可溶性糖含景以“渝薯34”最高，為128.92(mg/g，DM)，除與“南薯88”的差異不顯著外，與其他7個供試品種的差異均達極顯著；“南薯88”次之，為119.05(mg/g，DM)，顯著高于“渝蘇162”、“渝蘇303”和“徐薯22”，

5、極顯著高于“渝薯153”、“西農(nóng)薯2號”、“渝薯123”和“徐薯18”。生長期之間比較，其平均塊根可溶性糖含量以栽插后50 d最高，為162.29(mg/g，DM)，極顯著高于85 d、108 d、136 d和165 d；栽插后85 d次之，除與栽插后165 d差異不顯著外，與栽插后108 d、136 d的差異均達到顯著水平。品種×生長期互作效應(yīng)極顯著，說明甘薯品種塊根可溶性糖含量在生長期之間的變化因品種不同而極顯著不同。 二、

6、IbSuSy和IbUGP的克隆與生物信息學分析 1、根據(jù)已報道的植物SuSy保守序列設(shè)計引物，以提取的甘薯植株總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，擴增獲得長度為707 bp的核心片段，BLASTn分析表明該片段具有SuSy序列特征；根據(jù)IbSuSy核心片段設(shè)計RACE巢式引物，擴增獲得IbSuSy長度為1055 bp的5’末端和1185 bp的3’末端；根據(jù)拼接的電子全長設(shè)計引物，擴增得IbSuSy物理全長為2698 bp。

7、 2、通過對IbSuSy的生物信息學分析表明：該基因編碼長度為727個氨基酸(aa)殘基的SuSy蛋白(IbSuSy)，分子量(Mw)為83.26 kDa，等電點(pI)為5.63；甘薯IbSuSy序列與馬鈴薯SuSy的相似性最高，達到91％；亞細胞定位預測等預測表明該蛋白定位于線粒體，為非跨膜的親水性蛋白。IbSuSy二級結(jié)構(gòu)預測表明其含有42.09％的α—螺旋、39.20％的隨機卷曲和18.71％的延伸主鏈；功能結(jié)構(gòu)域分析顯示該

8、酶存在兩個典型的功能結(jié)構(gòu)域，即7-554氨基酸組成的N—端區(qū)段(Sucrose—Synth)和565-727氨基酸殘基的C—端區(qū)段(Glycose—transf-1)，分別行使蔗糖合成和糖基轉(zhuǎn)移的功能。 3、根據(jù)已報道的植物UGP保守序列設(shè)計引物，以提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，擴增得到502 bp的核心片段，BLASTn分析表明該片段具有典型的UGP蛋白序列特征；根據(jù)此核心片段設(shè)計RACE巢式引物，擴增獲得長度為5

9、43 bp的5’末端和長度為976bp的3’末端；根據(jù)拼接的IbUGP電子全長設(shè)計引物，擴增獲得物理全長，長度為1736 bp。 4、通過對IbUGP的生物信息學分析推導該基因編碼470個aa殘基組成的UGP蛋白(IbUGP)，Mw為51.40 kDa，pI為5.65；IbUGP序列與馬鈴薯UGP的相似性高達91％，與甘蔗的UGP相似性達87％；通過亞細胞定位預測排除了定位于線粒體、質(zhì)體、跨膜的可能性，預測能定位于胞液。二級結(jié)構(gòu)

10、預測IbUGP包含47.45％的隨機卷曲、33.40％的α—螺旋和19.15％的延伸主鏈；三維結(jié)構(gòu)建模表明該蛋白具有典型UGP蛋白的四個結(jié)構(gòu)域，分別為中心結(jié)構(gòu)域、C端結(jié)構(gòu)域、N端結(jié)構(gòu)域和糖結(jié)構(gòu)域；活性位點氨基酸殘基包括：Lys263、Lys329、Lys367、Lys409、Lys410。 5、通過以甘薯栽插后90 d、120 d、150 d和收獲于150 d并于4℃貯藏2周的塊根為材料，采用半定量RT—PCR(One Step

11、 RT—PCR)的方法對IbUGP基因的表達進行時間和組織表達分析。結(jié)果顯示，該基因在栽插后120 d表達量最高，栽插后150 d時表達量次之，而在栽插后90 d和4℃貯藏2周的塊根中幾乎檢測不到；在栽插后150 d同一植株不同組織中IbUGP均有表達，但在塊根中表達量最高，嫩葉和老葉中表達量次之，葉柄和莖中表達量最少。 本研究調(diào)查了9個甘薯品種在5個生長期的塊根可溶性糖含量變化，為甘薯育種和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)能提供一定的科學依據(jù)。同時