甘薯塊根可溶性糖含量在生長(zhǎng)期間的變化及IbSuSy基因和IbUGP基因的克隆.pdf

1、甘薯是世界上重要的糧食、飼料和工業(yè)原料用作物，是全球種植的主要作物之一。我國(guó)甘薯常年種植面積超過(guò)9000萬(wàn)畝，占世界甘薯栽培面積的85％以上，年產(chǎn)量超過(guò)1億噸，居世界首位。面對(duì)全球能源危機(jī)和糧食危機(jī)，甘薯在發(fā)展生物質(zhì)能源和作為主要糧食重要補(bǔ)充中扮演著十分重要的角色，是我國(guó)首選的生物質(zhì)能源作物和主要糧食補(bǔ)充作物。 甘薯塊根可溶性糖含量，是重要的品質(zhì)性狀之一，其含量的高低和變化很大程度上決定了甘薯的食品品質(zhì)、加工品質(zhì)以及抗逆性。蔗糖

2、是植物可溶性糖中含量最高的一種重要的糖類(lèi)，只有轉(zhuǎn)化為已糖或磷酸已糖后才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)參與其他代謝。而上述這一轉(zhuǎn)化過(guò)程是通過(guò)一系列的酶促反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。蔗糖合成酶(Sucrose synthase，SuSy)裂解蔗糖，是蔗糖轉(zhuǎn)化為已糖或磷酸已糖這一過(guò)程中的關(guān)鍵酶。植物中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(Uridinediphosphate—gluicose Pyrophophorylase，UGP)催化淀粉糖化過(guò)程第一步反應(yīng)并合成UDPG，處于蔗糖

3、和淀粉途徑的交叉點(diǎn)，為淀粉、蔗糖和其他結(jié)構(gòu)多糖直接或間接地提供前體物質(zhì)。因此，研究糖代謝途徑中上述兩種關(guān)鍵酶基因有著重要的意義。 本文在研究9個(gè)甘薯專(zhuān)用型品種在5個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期中塊根可溶性糖含量的變化的基礎(chǔ)上，以含有甘薯近緣植物(Ipomoea trifida)1/8血緣的甘薯新品種“渝蘇303”為材料，對(duì)糖代謝途徑關(guān)鍵酶基因蔗糖合成酶(IbSuSy)基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(IbUGP)基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析。其結(jié)果

4、如下： 一、甘薯生長(zhǎng)期間塊根可溶性糖含量的變化 通過(guò)對(duì)9個(gè)甘薯品種、5個(gè)生長(zhǎng)期的雙因素試驗(yàn)，甘薯品種塊根可溶性糖含量的品種效應(yīng)、生長(zhǎng)期效應(yīng)和品種×生長(zhǎng)期互作效應(yīng)均達(dá)到極顯著。品種間塊根可溶性糖含景以“渝薯34”最高，為128.92(mg/g，DM)，除與“南薯88”的差異不顯著外，與其他7個(gè)供試品種的差異均達(dá)極顯著；“南薯88”次之，為119.05(mg/g，DM)，顯著高于“渝蘇162”、“渝蘇303”和“徐薯22”，

5、極顯著高于“渝薯153”、“西農(nóng)薯2號(hào)”、“渝薯123”和“徐薯18”。生長(zhǎng)期之間比較，其平均塊根可溶性糖含量以栽插后50 d最高，為162.29(mg/g，DM)，極顯著高于85 d、108 d、136 d和165 d；栽插后85 d次之，除與栽插后165 d差異不顯著外，與栽插后108 d、136 d的差異均達(dá)到顯著水平。品種×生長(zhǎng)期互作效應(yīng)極顯著，說(shuō)明甘薯品種塊根可溶性糖含量在生長(zhǎng)期之間的變化因品種不同而極顯著不同。 二、

6、IbSuSy和IbUGP的克隆與生物信息學(xué)分析 1、根據(jù)已報(bào)道的植物SuSy保守序列設(shè)計(jì)引物，以提取的甘薯植株總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為707 bp的核心片段，BLASTn分析表明該片段具有SuSy序列特征；根據(jù)IbSuSy核心片段設(shè)計(jì)RACE巢式引物，擴(kuò)增獲得IbSuSy長(zhǎng)度為1055 bp的5’末端和1185 bp的3’末端；根據(jù)拼接的電子全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增得IbSuSy物理全長(zhǎng)為2698 bp。

7、 2、通過(guò)對(duì)IbSuSy的生物信息學(xué)分析表明：該基因編碼長(zhǎng)度為727個(gè)氨基酸(aa)殘基的SuSy蛋白(IbSuSy)，分子量(Mw)為83.26 kDa，等電點(diǎn)(pI)為5.63；甘薯IbSuSy序列與馬鈴薯SuSy的相似性最高，達(dá)到91％；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)等預(yù)測(cè)表明該蛋白定位于線粒體，為非跨膜的親水性蛋白。IbSuSy二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明其含有42.09％的α—螺旋、39.20％的隨機(jī)卷曲和18.71％的延伸主鏈；功能結(jié)構(gòu)域分析顯示該

8、酶存在兩個(gè)典型的功能結(jié)構(gòu)域，即7-554氨基酸組成的N—端區(qū)段(Sucrose—Synth)和565-727氨基酸殘基的C—端區(qū)段(Glycose—transf-1)，分別行使蔗糖合成和糖基轉(zhuǎn)移的功能。 3、根據(jù)已報(bào)道的植物UGP保守序列設(shè)計(jì)引物，以提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，擴(kuò)增得到502 bp的核心片段，BLASTn分析表明該片段具有典型的UGP蛋白序列特征；根據(jù)此核心片段設(shè)計(jì)RACE巢式引物，擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為5

9、43 bp的5’末端和長(zhǎng)度為976bp的3’末端；根據(jù)拼接的IbUGP電子全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得物理全長(zhǎng)，長(zhǎng)度為1736 bp。 4、通過(guò)對(duì)IbUGP的生物信息學(xué)分析推導(dǎo)該基因編碼470個(gè)aa殘基組成的UGP蛋白(IbUGP)，Mw為51.40 kDa，pI為5.65；IbUGP序列與馬鈴薯UGP的相似性高達(dá)91％，與甘蔗的UGP相似性達(dá)87％；通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)排除了定位于線粒體、質(zhì)體、跨膜的可能性，預(yù)測(cè)能定位于胞液。二級(jí)結(jié)構(gòu)

10、預(yù)測(cè)IbUGP包含47.45％的隨機(jī)卷曲、33.40％的α—螺旋和19.15％的延伸主鏈；三維結(jié)構(gòu)建模表明該蛋白具有典型UGP蛋白的四個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為中心結(jié)構(gòu)域、C端結(jié)構(gòu)域、N端結(jié)構(gòu)域和糖結(jié)構(gòu)域；活性位點(diǎn)氨基酸殘基包括：Lys263、Lys329、Lys367、Lys409、Lys410。 5、通過(guò)以甘薯栽插后90 d、120 d、150 d和收獲于150 d并于4℃貯藏2周的塊根為材料，采用半定量RT—PCR(One Step

11、 RT—PCR)的方法對(duì)IbUGP基因的表達(dá)進(jìn)行時(shí)間和組織表達(dá)分析。結(jié)果顯示，該基因在栽插后120 d表達(dá)量最高，栽插后150 d時(shí)表達(dá)量次之，而在栽插后90 d和4℃貯藏2周的塊根中幾乎檢測(cè)不到；在栽插后150 d同一植株不同組織中IbUGP均有表達(dá)，但在塊根中表達(dá)量最高，嫩葉和老葉中表達(dá)量次之，葉柄和莖中表達(dá)量最少。 本研究調(diào)查了9個(gè)甘薯品種在5個(gè)生長(zhǎng)期的塊根可溶性糖含量變化，為甘薯育種和產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)能提供一定的科學(xué)依據(jù)。同時(shí)