基于微納熱電偶探極的單細胞測溫研究.pdf

1、細胞是生命體的最小結(jié)構(gòu)和功能單位，細胞的生長、分裂、新陳代謝，都從一個側(cè)面反應(yīng)生命體的生命狀態(tài)和健康程度。對單個細胞的研究不僅有利于解釋細胞及生物體的生理活動，而且有利于研究疾病的發(fā)病與治療機理。生化指標和理化性質(zhì)是單細胞檢測的重要研究對象，它可以揭示不同細胞在各種蛋白表達、pH值、溫度、酶活性等方面的差異性，有利于疾病的早期診斷。
　　環(huán)境溫度參數(shù)是細胞生存、增殖的重要參數(shù)，環(huán)境溫度的高低直接影響細胞新陳代謝的進程。反過來看，細

2、胞的新陳代謝包含了物質(zhì)代謝和能量代謝，細胞內(nèi)的各種活動，包括原料組裝成大分子，廢棄物的產(chǎn)生和排放，遺傳信息的傳遞，泵離子跨膜運輸?shù)?，都必須獲取和消耗能量。而能量在轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化的過程中，必然伴隨著熱能產(chǎn)生。這些熱能的產(chǎn)生可能會改變細胞內(nèi)環(huán)境溫度。因此，單細胞溫度測量可能為了解細胞內(nèi)生化反應(yīng)及生物過程提供新的研究手段。
　　然而，細胞具有尺寸小、胞內(nèi)組分復(fù)雜、被測組分含量很低、隨外界環(huán)境(如溶液組分、溫度、pH)而發(fā)生變化等特點。這些特

3、點對單細胞操縱、環(huán)境控制及探測靈敏度等方面提出了很高的要求。因此，實現(xiàn)單個細胞內(nèi)溫度的測量，需要研究和開發(fā)與單個細胞尺寸相匹配、高靈敏度的溫度傳感器。目前世界范圍內(nèi)，測量單個細胞的溫度還沒有成熟的技術(shù)和儀器，一些研究還處于起步階段。因此，本論文設(shè)計制作了基于熱電偶原理的微納測溫探極，并用于檢測細胞內(nèi)的溫度變化。
　　論文第二章設(shè)計并制作了可以穿刺進入細胞內(nèi)的微納熱電偶測溫探極，其測溫端尺寸可達亞微米級乃至納米級。在第三章中，對微納

4、熱電偶探極進行溫度定標，以此建立電壓信號與溫度信號的函數(shù)關(guān)系。建立了單細胞測溫系統(tǒng)，通過絕熱屏蔽裝置，將環(huán)境溫度變化控制在0.15℃范圍內(nèi)；通過使用微納熱電偶探極的操控單元的可以精確控制探極的穿刺細胞，分辨率達到50nm，最大穿刺速度達360mm/s；通過對信號的采集處理，得到了較高的溫度分辨率，達到0.06℃(時間分辨率為0.1s)和0.2℃(時間分辨率為0.001s)本論文第四章使用建立的細胞測溫系統(tǒng)，在不同濃度、不同種類的抗癌藥物

5、作用下，對U251膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)溫度信號變化進行了初步研究，可能為抗癌藥物篩選提供新的方法。
　　論文的主要研究內(nèi)容及取得的研究成果如下：
　　1.設(shè)計單細胞測溫探極結(jié)構(gòu)
　　基于適合細胞測溫的原則設(shè)計探極結(jié)構(gòu)：探極的尖端尺寸需盡量小，以便插入細胞內(nèi)部，末端尺寸必須有利于探極的固定和信號的采集。因此，錐形作為測溫探極的形狀是較為合適的。根據(jù)熱電偶測溫的原理，兩種不同材質(zhì)的金屬接觸才能形成測溫結(jié)。因此，在錐形結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，

6、設(shè)計了同軸的三層結(jié)構(gòu)，由內(nèi)而外分別為探極的基極、介質(zhì)層和外極。其中探極的基極為錐形，且只有尖端與外極連接，基極的其余部分被介質(zhì)層所包覆，不與外極接觸，基極與外極的接觸部分形成微納尺寸的測溫結(jié)。
　　2.成功制備微納熱電偶測溫探極并對測溫探極進行溫度定標
　　為了兼顧微納熱電偶探極的機械強度、熱電動勢和生物相容性，選擇鉑、鎢和聚氨酯作為探極制備材料。使用了電化學(xué)腐蝕的方法制備了探極的基極，其尖端曲率半徑小于200nm，錐角約為

7、10°左右。通過微納控制技術(shù)在基極外包裹介質(zhì)層(裸露尖端)，通過控制實驗條件，可得到表面光滑，界限清晰的介質(zhì)層。利用直流濺射技術(shù)制備外極，制備膜厚約為100nm的Pt薄膜外極。通過以上步驟可穩(wěn)定制備微納熱電偶測溫探極，其測溫端尺寸為亞微米級。
　　使用一等標準水銀溫度計和高精度電壓表對微納熱電偶探極進行溫度定標，并通過通過曲線擬合，得到溫度與熱電動勢的函數(shù)關(guān)系式和探極的Seebeck系數(shù)(4.6μV/℃至10.2μV/℃，分別為0

8、℃和90℃時的值)。
　　3.建立單細胞測溫系統(tǒng)
　　建立的單細胞測溫系統(tǒng)主要包括絕熱屏蔽箱、環(huán)境監(jiān)測裝置、熒光倒置顯微鏡、微納熱電偶探極的操控單元、微納熱電偶信號采集處理部分等。絕熱屏蔽箱可以使箱內(nèi)溫度不受環(huán)境干擾，通過環(huán)境監(jiān)測裝置可以監(jiān)測箱內(nèi)環(huán)境的變化范圍，使用微納探極的操控單元和熒光顯微鏡可以實時觀察和操控探極穿刺細胞，其操控分辨率達50nm，最大穿刺速度360mm/s。通過信號采集部分可以實時監(jiān)測細胞內(nèi)溫度信號的變化

9、，溫度分辨率可達0.06℃。
　　4.研究了不同濃度、不同種類的抗癌藥物刺激下，單個細胞內(nèi)溫度信號變化
　　使用了建立的單細胞測溫系統(tǒng)對細胞內(nèi)溫度進行了研究。首先使細胞培養(yǎng)液和需加藥物與環(huán)境溫度達到熱平衡后，將測溫探極穿刺入細胞，在不同濃度、不同種類的抗癌藥物(喜樹堿、阿霉素和紫杉醇)作用下，研究了單個U251細胞內(nèi)溫度信號變化。實驗得出初步結(jié)論，使用的幾種濃度的喜樹堿都可使U251細胞內(nèi)溫度升高，并伴隨信號波動，而阿霉素和