轉(zhuǎn)cry1Ah基因玉米對蜜蜂中腸細(xì)菌群落和土壤微生物群落的影響.pdf

1、蜜蜂是很多農(nóng)作物和野生植物的傳粉者,在生態(tài)和經(jīng)濟(jì)中扮演著非常重要的角色,是一種關(guān)鍵的非靶標(biāo)生物。目前我國人工飼養(yǎng)的蜜蜂主要是意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica),它在植物授粉和維持生態(tài)平衡中起著非常重要作用。轉(zhuǎn)基因作物對授粉蜜蜂是否產(chǎn)生不良影響,是人們目前非常關(guān)注的焦點(diǎn)問題之一。由于植物和土壤微生物通過根際效應(yīng)相互制約,相互促進(jìn),轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響是評價轉(zhuǎn)基因作物安全性的重要指標(biāo)。

2、本文以自主研發(fā)的對亞洲玉米螟有高毒力的轉(zhuǎn)cryAh基因玉米為實(shí)驗(yàn)材料,研究其對意大利蜜蜂中腸細(xì)菌群落和土壤微生物群落的影響,為轉(zhuǎn)基因植物的安全性評價體系提供理論依據(jù)。主要結(jié)果如下:
　　 1、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)轉(zhuǎn)cryAh基因玉米花粉對意大利蜜蜂中腸細(xì)菌群落影響分別用轉(zhuǎn)基因玉米花粉糖水、常規(guī)玉米花粉糖水、含高濃度質(zhì)粒糖水、線性crylAh片段糖水、糖水空白對照組在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼喂意大利蜜蜂。兩周之后,進(jìn)行解剖,提取腸道細(xì)菌基因組DNA,用免培

3、養(yǎng)技術(shù)----變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Eleetrophoresis,DGGE)分析五個處理組蜜蜂腸道細(xì)菌群落的組成。結(jié)果表明,五個處理組DGGE圖譜中Shannon's指數(shù)在2.51-2.79之間,群落分布均勻度指數(shù)為0.99-1.01,不同處理組蜜蜂中腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異不顯著。對DGGE圖譜中的特異條帶進(jìn)行回收克隆測序分析,序列分析結(jié)果主要屬于厚壁菌門(Firmieutes)、變形菌門(

4、Proteobactefia)和放線菌類(Actinobacteria)。Firmieutes主要由乳桿菌(Lactobacillussp.)組成,Proteobacteria包含有α-,β-,γ-Proteobactefia,還有部分菌分類地位未確定。
　　 2、田間網(wǎng)室轉(zhuǎn)crylAh基因玉米花粉對意大利蜜蜂中腸細(xì)菌群落影響在田間網(wǎng)室內(nèi)分別種植轉(zhuǎn)基因玉米和常規(guī)玉米。在玉米盛花期時放入蜂群,每個網(wǎng)室放入三箱蜂群,每箱大約1000

5、0只蜜蜂。對剛出房的幼蟲和工蜂進(jìn)行標(biāo)記,對標(biāo)記后食花粉0天、3天、6天、9天的幼蟲分別取樣,每個處理組三個重復(fù);對標(biāo)記后食花粉0天、15天、30天的工蜂分別取樣,每個處理組三個重復(fù)。提取腸道細(xì)菌基因組DNA,用DGGE技術(shù)分析不同處理組蜜蜂腸道細(xì)菌群落的組成。結(jié)果表明,不同天數(shù)幼蟲處理組DGGE圖譜中Shannon’s指數(shù)在2.88-3.11之間,群落分布均勻度指數(shù)為0.99-1.01,不同天數(shù)幼蟲蜜蜂中腸細(xì)菌群落組成差異不顯著。對DG

6、GE圖譜中的特異條帶進(jìn)行回收測序,序列分析主要屬于厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)。不同天數(shù)工蜂處理組DGGE圖譜中Shannon’s指數(shù)在2.60-2.78之間,群落分布均勻度指數(shù)為0.99-1.00,不同天數(shù)工蜂中腸細(xì)菌群落組成沒有顯著性差異。對DGGE圖譜中的特異條帶進(jìn)行回收測序,序列分析主要屬于厚壁菌門(Firmieutes)和變形菌門(Proteobacteria)和放線菌類(Acti

7、nobactefia)。
　　 3、轉(zhuǎn)crylAh基因玉米對根際土壤微生物群落的影響采用傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法分析根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和放線菌;同時用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)和BIOLOG方法,對轉(zhuǎn)crylAh基因抗蟲玉米根部土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:在玉米生長0天、15天、30天、60天、90天、180天土壤樣品取樣分析,根部可培養(yǎng)的微生物隨時間變化有一定的消長,但同一時間內(nèi)轉(zhuǎn)基因玉米與

8、非轉(zhuǎn)基因玉米二者根部可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量差異不顯著。同時變性梯度凝膠電泳的結(jié)果顯示,在玉米的整個生長期內(nèi),根部土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)為2.40-2.70,群落分布均勻度指數(shù)為0.96-0.99:根部土壤真菌群落多樣性指數(shù)為2.17-2.48,群落分布均勻度指數(shù)為0.95-0.99:轉(zhuǎn)基因玉米和常規(guī)玉米根部土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)變化差異并不顯著。對DGGE圖譜中的特異條帶進(jìn)行回收測序,細(xì)菌序列分析主要屬于厚壁菌門(Firmic

9、utes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌類(Actinobacteria)和未知菌類(Unknown);真菌序列分析主要是擔(dān)子菌(Basidiomycotina)、半知菌(Deuteromycotina)、子囊菌(Ascomycotina)、接合菌(zygomycotina)和一些未知真菌類。在玉米生長0天、30天、90天、180天土壤樣品進(jìn)行BIOLOG分析,結(jié)果顯示:微生物群落的孔平均顏色變化率值、Shannon