泥蚶大規(guī)模死亡的病原生物學(xué)及其宿主血細(xì)胞免疫特性研究.pdf

1、泥蚶是重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類，但近年來泥蚶病害問題日益突出，大規(guī)模死亡頻繁發(fā)生，造成較大損失。查明大規(guī)模死亡病因，加強(qiáng)泥蚶病害免疫預(yù)防研究，對促進(jìn)泥蚶養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展、豐富貝類免疫學(xué)理論具有重要意義。本研究采用光鏡、電鏡、流式細(xì)胞儀、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物信息學(xué)等技術(shù)，對樂清灣泥蚶大規(guī)模死亡原因進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，并對泥蚶血細(xì)胞免疫特性以及血淋巴中免疫相關(guān)的天冬氨酸消旋酶基因進(jìn)行了研究。
　　 1.2005年至2009年樂清灣養(yǎng)

2、殖泥蚶多次發(fā)生大量死亡。一種專性寄生于細(xì)胞內(nèi)的原核微生物，在瀕死和死亡的泥蚶中多次被檢測到。這些原核微生物通常呈圓形、橢圓形或啞鈴形;大小在0.28μm和0.71μm之間;為三層細(xì)胞膜結(jié)構(gòu);具有橫二分裂和出芽兩種繁殖方式。這種原核微生物能形成細(xì)胞內(nèi)嗜曙紅性的包涵體。這些包涵體主要分布于外套膜、鰓、消化管的上皮組織和結(jié)締組織中。根據(jù)生物學(xué)和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，推測該原核微生物屬于立克次氏體科，定名為類立克次氏體(RLO)。這種RLO表現(xiàn)出較強(qiáng)的致

3、病性。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)被RLO感染的細(xì)胞呈現(xiàn)嚴(yán)重的病理變化;組織的破壞程度與RLO包涵體的數(shù)量正相關(guān);細(xì)胞病變程度與細(xì)胞內(nèi)RLO數(shù)量正相關(guān);具有相似特征的RLO及其包涵體，在不同養(yǎng)殖場、不同發(fā)病時間所采集的泥蚶病樣中都有發(fā)現(xiàn);RLO感染強(qiáng)度與泥蚶死亡率正相關(guān)。為此，認(rèn)為RLO感染與樂清灣養(yǎng)殖泥蚶大量死亡有密切聯(lián)系。
　　 2.根據(jù)細(xì)胞大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)、顆粒特點(diǎn)，光鏡下可將泥蚶血細(xì)胞區(qū)分為紅色顆粒細(xì)胞(占89.67％)、嗜堿性顆粒細(xì)胞

4、（占7.05％）、透明細(xì)胞（占3.28％）三種主要類型。健康泥蚶血淋巴中血細(xì)胞平均密度為3.29±0.82×106cell/mL。透射電鏡下觀察到顆粒細(xì)胞Ⅰ型、顆粒細(xì)胞Ⅱ型、無顆粒細(xì)胞;掃描電鏡觀察下，細(xì)胞表面光滑，部分細(xì)胞表面有小的突起物。用流式細(xì)胞儀檢測出P1(13.13％)和P2(78.83％)兩個細(xì)胞亞群以及沒有固定形態(tài)的細(xì)胞（近8％）。利用APIZYM試劑盒對健康泥蚶血細(xì)胞及血清中的19種酶進(jìn)行檢測，在血細(xì)胞中檢測到11種酶，

5、在血清中檢測到了13種酶，經(jīng)酵母聚糖刺激后，堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、類脂脂酶、N-乙酰葡萄糖胺酶在血細(xì)胞和血清中水平大幅升高。體外吞噬實(shí)驗(yàn)揭示紅色顆粒細(xì)胞對酵母聚糖具有明顯的吞噬能力，嗜堿性顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞吞噬作用不顯著;在經(jīng)嗜水氣單胞桿菌刺激后，嗜堿性顆粒細(xì)胞出現(xiàn)大量聚集現(xiàn)象，透明細(xì)胞能吸附顆粒物。吞噬活性研究表明，溫度、鹽度對泥蚶血細(xì)胞的吞噬活性有顯著的影響，在泥蚶適宜生長溫度(13-30℃)區(qū)間和最適鹽度(20.0-26.2pp

6、t)區(qū)間，血細(xì)胞吞噬活性達(dá)到最高值。
　　 3.從泥蚶血細(xì)胞中克隆出天冬氨酸消旋酶(AR)基因，泥蚶AR基因的ORF序列全長1017bp，編碼338個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為37.1 kDa，理論等電點(diǎn)為8.62，為堿性蛋白。序列分析發(fā)現(xiàn)，泥蚶氨基酸序列與魁蚶AR氨基酸序列的同源性達(dá)到93％，與海膽和海鞘的AR氨基酸序列同源性為51％和41％。聚類分析表明，泥蚶AR能與所有已報道的生物AR聚合在一起，表明成功克隆了泥蚶天冬氨酸消