兔MSCs與NGF-SF-Gt支架修復(fù)糖尿病兔下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病的發(fā)病病因是多種的，包括:免疫、微生物感染、自由基毒素、遺傳、精神等諸多因素，導(dǎo)致胰島素降低、胰島細(xì)胞功能減退。常見糖尿病患者會(huì)因骨量減低而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和骨折發(fā)生率增加?，F(xiàn)今，腫瘤切除、創(chuàng)傷、感染發(fā)生在糖尿病患者常引起骨質(zhì)流失，嚴(yán)重的導(dǎo)致骨缺損。但是，當(dāng)骨缺損發(fā)生于糖尿病患者，骨愈合緩慢，或者不愈合便成為了難以解決的問題。
　　組織工程的基本原則是綜合應(yīng)用工程和生命科學(xué)，其基本理論技術(shù)和方法，植入在體外預(yù)先

2、構(gòu)建的生物活性體于待修復(fù)組織缺損處，用以替代組織和器官功能。也可作為一個(gè)體外裝置，臨時(shí)性替代器官的功能，以提高生活和生存質(zhì)量并延長生命活動(dòng)。
　　本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖浅醪教接懶迯?fù)糖尿病兔下頜骨缺損的方法。利用組織工程的方法，通過制備絲素-明膠(SF-Gt)三維多孔共混支架并對支架性能進(jìn)行檢測，通過接種人成骨細(xì)胞hFOB1.19，并添加神經(jīng)生長因子后體外研究其在神經(jīng)生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)支架三維多孔共混支架中的生長狀態(tài)及

3、對細(xì)胞粘附、增殖、分化及成骨性能的影響。此外，制備兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的和誘導(dǎo)成骨后復(fù)合于神經(jīng)生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)支架，用于修復(fù)糖尿病兔的下頜骨骨缺損區(qū)域并評估神經(jīng)生長因子-絲素-明膠作為骨組織工程支架生物相容性，以及對糖尿病患者骨缺損區(qū)域的組織修復(fù)再生的作用。為進(jìn)一步再構(gòu)建更為理想的組織工程化復(fù)合物治療糖尿病骨缺損提供理論參數(shù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、制備絲素-明膠(SF-Gt)多孔

4、支架，并測試SF-Gt多孔支架的孔隙率、溶脹率、吸水率、并對其機(jī)械性能進(jìn)行檢測;采用掃描電鏡(SEM)和MTT的方法進(jìn)一步檢測材料生物相容性。
　　2、將神經(jīng)生長因子復(fù)合于絲素-明膠(NGF-SF-Gt)三維多孔支架材料;提取、傳代及擴(kuò)增人成骨細(xì)胞hFOB1.19及形態(tài)學(xué)觀察并與神經(jīng)生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)多孔支架以及絲素-明膠(SF-Gt)支架復(fù)合培養(yǎng);應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞粘附情況、掃描電鏡(SEM)觀察、C

5、CK-8法檢測、ALP細(xì)胞活性法，研究并比較人成骨細(xì)胞在神經(jīng)生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)支架材料和絲素-明膠(SF-Gt)三維多孔支架中的增殖、粘附、分化等成骨性能。
　　3、原代培養(yǎng)兔的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)并傳代并進(jìn)行觀察、計(jì)算細(xì)胞生長曲線、使用成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行骨誘導(dǎo)、并對細(xì)胞進(jìn)行鑒定;復(fù)合兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)細(xì)胞于神經(jīng)生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)支架材料中，掃描電鏡(SEM)觀察細(xì)胞

6、生長情況。
　　4、糖尿病兔模型的建立，通過兔血糖體重的變化討論糖尿病兔成模情況;兔下頜骨缺損模型的制備，并植入神經(jīng)生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)支架及絲素-明膠(SF-Gt)三維多孔支架并設(shè)立對照組;對糖尿病兔下頜骨缺損模型修復(fù)情況進(jìn)行大體和組織學(xué)觀察、并且使用影像學(xué)分析、骨小梁百分比面積測定、骨密度測定、生物力學(xué)測定、及計(jì)算機(jī)圖像分析等方法檢側(cè)其組織相容性。
　　結(jié)果：
　　1、絲素-明膠(SF-Gt)

7、三維多孔支架的孔隙率、溶脹率、吸水率及其機(jī)械性能顯示在預(yù)凍溫度為-40℃時(shí)材料的性能較符合骨組織工程的要求;通過掃描電鏡(SEM)檢測絲素-明膠(SF-Gt)三維多孔支架表面，結(jié)果顯示材呈多孔狀，細(xì)胞粘附生長有利;MTT結(jié)果顯示由京尼平交聯(lián)材料細(xì)胞毒性小于甲醇交聯(lián)材料。
　　2、人成骨細(xì)胞hFOB1.19與神經(jīng)生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)三維多孔支架及絲素-明膠(SF-Gt)三維多孔支架聯(lián)合共培養(yǎng)并設(shè)立對照組;人成骨

8、細(xì)胞hFOB1.19粘附率，CCK-8定量測定和ALP活性結(jié)果顯示培養(yǎng)7天后，神經(jīng)生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)組支架材料的細(xì)胞增殖，分化結(jié)果明顯高于絲素-明膠(SF-Gt)組也高于對照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)經(jīng)原代培養(yǎng)及傳代后細(xì)胞密集生長，傳至第3代第3天后細(xì)胞數(shù)量急劇增加，在第6天時(shí)細(xì)胞數(shù)量增加到最高，經(jīng)鑒定結(jié)果顯示加入成骨誘導(dǎo)液后細(xì)胞得形態(tài)發(fā)生改變可向成骨

9、細(xì)胞分化;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)經(jīng)原代培養(yǎng)后，我們掃描電鏡觀察材料表面，可見細(xì)胞爬行過程。
　　4、按100mg/kg靜脈注射四氧嘧啶(ALX)后，糖尿病模型的建模率為87.5％，死亡率為16.67％，證明可形成穩(wěn)定的糖尿病模型;于糖尿病兔下頜骨缺損臨界骨缺損模型，分別加入骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合的神經(jīng)生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)支架組及該細(xì)胞復(fù)合的絲素-明膠(SF-Gt)支架組后設(shè)立對照組。術(shù)后4、8、12周進(jìn)行大

10、體和組織學(xué)觀察、并且使用影像學(xué)分析、骨小梁百分比面積測定、骨密度測定、生物力學(xué)測定、及計(jì)算機(jī)圖像分析。結(jié)果表明加入材料后，12周時(shí)，含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)生長因子-絲素-明膠(MSCs-NGF-SF-Gt)多孔支架組糖尿病兔骨缺損區(qū)域的骨形成情況優(yōu)于其他組;生物力學(xué)測定結(jié)果顯示:術(shù)后4、8、12周，抗彎強(qiáng)度結(jié)果隨時(shí)間延長而增大，在神經(jīng)生長因子-絲素-明膠(MSCs-NGF-SF-Gt)組從4周起強(qiáng)度開始增大。而在含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的的

11、絲素-明膠(MSCs-SF-Gt)組，其增大幅度平緩。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合的絲素-明膠(MSCs-SF-Gt)組及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合的神經(jīng)生長因子-絲素-明膠(MSCs-NGF-SF-Gt)組抗彎強(qiáng)度明顯高于空白對照組和糖尿病對照組，12周時(shí)，顯著性水平更為明顯(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、本實(shí)驗(yàn)成功建立絲素-明膠(SF-Gt)多孔支架模型，在預(yù)凍溫度為-40℃時(shí)材料的性能有望符合骨組織工程的需要;用京尼平交聯(lián)

12、三維共混多孔支架毒性比甲醇交聯(lián)的材料更適宜細(xì)胞生長;實(shí)驗(yàn)采用京尼平交聯(lián)的絲素-明膠(SF-Gt)多孔支架材料具有較好的生物相容性。
　　2、凍干法成功將神經(jīng)生長因子(NGF)復(fù)合于絲素-明膠(SF-Gt)多孔支架;神經(jīng)生長因子(NGF)對人成骨細(xì)胞hFOB1.19在絲素-明膠(SF-Gt)多孔支架內(nèi)的生長有明顯的促進(jìn)作用。
　　3、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(MSCs)經(jīng)原代培養(yǎng)傳代后細(xì)胞生長密集，加入誘導(dǎo)液后細(xì)胞形態(tài)改變，向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)