Identification of Novel Nematicidal Crystal Proteins and Host--Pathogen Interactions in Bacillus Thuringiensis.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一種昆蟲(chóng)病原菌，其特征是在形成芽胞的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生由Cry蛋白組成的伴胞晶體，這些伴胞晶體對(duì)多種農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)具有毒殺活性。因此，Bt成為用于微生物農(nóng)藥最成功的微生物，此外，Bt的Cry蛋白基因也可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因作物的方式應(yīng)用于農(nóng)業(yè)上重要昆蟲(chóng)的防治。目前關(guān)于Bt Cry蛋白防治昆蟲(chóng)的研究相對(duì)較多，然而對(duì)于Cry蛋白防治線蟲(chóng)的研究還很有限。植物寄生線蟲(chóng)對(duì)農(nóng)作物造成重大的損失，因此需

2、要尋找對(duì)線蟲(chóng)具有較高毒性和較廣譜的新型Cry蛋白。基于此，本研究集中于分離新菌株并使用基因組分析的方法來(lái)發(fā)掘新型Cry蛋白基因的工作。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1)通過(guò)100個(gè)Bt基因組分析發(fā)現(xiàn)在20％的Bt基因組中存在cry基因片段化的現(xiàn)象，通過(guò)對(duì)其中一個(gè)片段化基因cry5B-LN的功能研究發(fā)現(xiàn)該片段化基因與另一Cry蛋白Cry5Ba的C端編碼序列融合表達(dá)時(shí)，可以形成典型的伴胞晶體，同時(shí)該融合晶體蛋白可以造成線蟲(chóng)腸道上皮細(xì)胞連接的

3、破壞，進(jìn)而表現(xiàn)出對(duì)線蟲(chóng)具有毒殺活性，本研究結(jié)果揭示了片段化的cry基因可以作為潛在的具有活性的毒素資源。
　　晶體蛋白典型的N端domain在毒素的活性及特異性上具有重要的角色功能，而C端domain幫助3D晶體結(jié)構(gòu)的形成。然而在大規(guī)模Bt基因組測(cè)序中發(fā)現(xiàn)某些片段化的Cry蛋白基因多是N端或者C端的現(xiàn)象。在本研究的第一部分，我們篩選了100個(gè)Bt基因組以調(diào)查這些片段化cry基因的發(fā)生。通過(guò)信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)除了65個(gè)完整的cry基因之

4、外，還有20個(gè)基因組中含有N端或C端的片段化基因。為了進(jìn)一步研究片段化基因的表達(dá)和功能，本研究以一個(gè)片段化基因?yàn)槔?，該基因?lái)自于具有殺線蟲(chóng)活性的Bt菌株C15的基因組，其編碼序列覆蓋了殺線蟲(chóng)晶體蛋白Cry5Ba N端的47％，且相似性為28％。因此將該片段化基因命名為cry5B-likeN端基因(cry5B-LN)。我們首先利用傳統(tǒng)的Bt表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)cry5B-LN，發(fā)現(xiàn)該基因片段無(wú)法表達(dá)。然而，當(dāng)將該片段與Cry5Ba的C端編碼序列

5、融合表達(dá)時(shí)，不僅可以表達(dá)晶體蛋白，還可以形成伴胞晶體，電子顯微鏡照片顯示融合成的晶體為雙棱錐形狀。通過(guò)秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）的生測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該N+C融合晶體蛋白對(duì)線蟲(chóng)具有明顯活性，其半致死濃度LC50為23.7μg/ml，能夠縮短線蟲(chóng)的壽命，同時(shí)影響線蟲(chóng)發(fā)育。通過(guò)鏡檢觀察融合蛋白處理后線蟲(chóng)的病理學(xué)變化發(fā)現(xiàn)該融合蛋白能夠造成線蟲(chóng)腸道的損傷，從而確定了該融合蛋白的作用部位。通過(guò)熒光顯微鏡觀察融合蛋白處理后

6、GFP標(biāo)記的線蟲(chóng)突變體FT63的表型變化發(fā)現(xiàn)該融合蛋白可以造成線蟲(chóng)腸道上皮細(xì)胞連接的破壞，從而確定了該融合蛋白的作用方式。以上結(jié)果表明這些片段化的Cry蛋白基因可能是毒性較高的新型Cry蛋白的來(lái)源。本研究對(duì)片段化基因的進(jìn)一步研究不僅有助于新型Cry蛋白基因資源的發(fā)掘，同時(shí)也有助于更好地研究Bt產(chǎn)生多結(jié)構(gòu)域毒素的進(jìn)化策略。
　　2)通過(guò)Bt基因組分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新型Cry蛋白Cry5Fa，該蛋白與已報(bào)道對(duì)線蟲(chóng)具有活性的Cry5Ba具有

7、一定相似性，但通過(guò)對(duì)該蛋白的活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Cry5Fa對(duì)具有Cry5Ba抗性的線蟲(chóng)突變體有毒殺活性，暗示了Cry5Fa是一種廣譜的具有殺線蟲(chóng)活性的新型晶體蛋白。
　　本研究通過(guò)對(duì)Bt菌株F-14的基因組分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)潛在的新型Cry蛋白，其保守結(jié)構(gòu)域與Cry5Ba具有一定的相似性，將其命名為Cry5Fa。序列分析表明,Cry5Fa的C端與Cry5Ba的C端的相似度更高，達(dá)到70％～80％，而Cry5Fa的N端與Cry5Ba的N端的相

8、似度只有20％～30％，兩個(gè)蛋白全長(zhǎng)的相似度為58％。通過(guò)傳統(tǒng)的Bt表達(dá)系統(tǒng)在Bt無(wú)晶體突變株BMB171中表達(dá)cry5Fa基因，發(fā)現(xiàn)該基因可以表達(dá)，并產(chǎn)生菱形晶體。通過(guò)對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)及其糖脂突變體的生測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cry5Fa對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)糖脂突變體（該突變體對(duì)Cry5Ba具有抗性）具有毒性，半致死濃度LC50為31μg/mL。該結(jié)果說(shuō)明Cry5Fa作用于線蟲(chóng)的作用機(jī)制可能與Cry5Ba不一樣。
　　3)通過(guò)信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Bt中存在

9、Aerolysin類(lèi)毒素Hydralysin，通過(guò)對(duì)該蛋白的活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的Hydralysin對(duì)線蟲(chóng)具有較低的活性，但與Cry5Ba復(fù)配時(shí)可以顯著提高Cry5Ba的毒性，說(shuō)明了Bt中的Hydralysin可以作為毒力因子協(xié)同增強(qiáng)Cry蛋白的毒性。
　　除了Cry蛋白之外，Bt還會(huì)產(chǎn)生大量的毒力因子參與殺蟲(chóng)的過(guò)程。這些毒力因子可以根據(jù)其序列和特異性進(jìn)行分類(lèi)。本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)基因(750bp)編碼32.5kDa的蛋白，通過(guò)序列分析