異檸檬酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)與功能研究及MRG15和PAM14相互作用方式的研究.pdf

1、異檸檬酸脫氫酶(IDH)是一大類酶家族，該酶催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸，在生物的能量產(chǎn)生和生物合成代謝中起著非常重要的作用。真核生物中以NADP為輔酶的異檸檬酸脫氫酶(NADP-IDH)具有很多重要的生物功能，但其動力學(xué)機制和活性調(diào)節(jié)機理目前還不清楚。我們以結(jié)構(gòu)生物學(xué)為研究手段，結(jié)合生物化學(xué)和分子生物學(xué)的方法來研究人源細胞質(zhì)NADP-IDH(HclDH)的動力學(xué)機制和活性調(diào)節(jié)機理。已得到該酶不同形式(野生型和突變體)及其相關(guān)復(fù)

2、合物的蛋白質(zhì)晶體，通過分析已有的結(jié)構(gòu)，進行了氨基酸點突變。Ser<'94>對應(yīng)于EclDH上發(fā)生可逆磷酸化調(diào)節(jié)酶活性的位點Ser<'113>，而Asp<'279>可以在沒有底物的條件下與Ser<'94>形成氫鍵。對這兩個位點我們設(shè)計完成了四個突變體，分別為S94A、S94D、D279A和D279N，它們對異檸檬酸和Mn<'2+>的K<,m>值都明顯增大，而對NADP的Km值幾乎沒有變化，其表現(xiàn)出的酶活性大大降低。同時，我們對影響NADP

3、結(jié)合的重要位點Arg<'314>和His<'315>進行了突變。除了R314K，其他的突變體都表現(xiàn)出對NADP的K<,m>值的變化，增大為野生型的25倍到90倍不等，而對異檸檬酸和Mn<'2+>的K<,m>值沒有明顯變化。這些結(jié)果表明Ser<'94>、Asp<'279>、Arg<'314>和His<'315>在酶催化反應(yīng)中都發(fā)揮著重要的作用，但起作用的方式又不盡相同，分別參與底物和輔酶的結(jié)合。通過分析結(jié)構(gòu)和酶學(xué)數(shù)據(jù)，我們提出HcIDH采

4、用穩(wěn)態(tài)隨機的酶促反應(yīng)動力學(xué)機制。我們的研究結(jié)果為闡明異檸檬酸脫氫酶的催化機制提供了依據(jù)，并幫助我們分析理解該酶的生物學(xué)功能。 MRG15是組織中廣泛表達的轉(zhuǎn)錄因子，在很多真核生物中都存在其同源物，它們共同組成了MRG蛋白家族。MRG15在胚胎發(fā)育、細胞增殖和細胞衰老過程中起重要作用。其羧基端獨立形成一個保守的MRG結(jié)構(gòu)域，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控中與Rb蛋白和另一核蛋白PAMl4的相互作用。在已有MRG結(jié)構(gòu)域(MRG15C)晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)

5、上，我們采用酵母雙雜交系統(tǒng)來研究MRG15上MRG結(jié)構(gòu)域(MRG15C)與PAM14的相互作用方式，基于結(jié)構(gòu)設(shè)計定點突變來尋找與PAM14結(jié)合中起作用的重要氨基酸位點。根據(jù)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，我們將PAM14截成三段(PAM14N、PAM14M和PAM14C)，發(fā)現(xiàn)PAM14N與MRG15C的相互作用最強。隨后我們進行了MRG15C單點突變和雙突變體與。PAM14N的酵母雙雜交實驗。我們的實驗結(jié)果為進一步闡明MRG15和PAM14的相互作用方