水稻谷氨酸合酶基因和胞質(zhì)異檸檬酸脫氫酶基因的功能研究以及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族分析.pdf

1、氮是植物必需的大量元素，對植物的生長發(fā)育至關(guān)重要，也是決定作物產(chǎn)量的重要因子。近年來，氮肥的大量施入雖然增加了作物產(chǎn)量，但對生態(tài)環(huán)境也造成了巨大的破壞。通過現(xiàn)代生物技術(shù)提高作物的氮素利用率(NUE)，是解決糧食增產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)這一矛盾的根本出路。水稻是我國最重要的糧食作物之一，其氮肥需求量巨大，提高水稻的NUE意義重大。
　　充分了解氮素吸收和同化關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能，對于深入解析碳氮代謝的分子機(jī)制，進(jìn)而通過精細(xì)調(diào)控提高作物NUE至

2、關(guān)重要。谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合酶(GS-GOGAT)循環(huán)是氮素同化過程中無機(jī)氮轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)氮的起點(diǎn)，也是碳氮結(jié)合的交叉點(diǎn)，在提高作物NUE工程中的重要性不言而喻。目前，人們對GOGAT基因在氮素吸收和碳氮代謝中扮演的角色仍未形成一個(gè)清晰的認(rèn)識，GS-GOGAT循環(huán)所需碳骨架（α-酮戊二酸，2OG）的供應(yīng)機(jī)制也未得到解析。本研究即以獲得的NADH-GOGAT及胞質(zhì)ICDH(NADP-依賴型異檸檬酸脫氫酶)受到抑制的兩類轉(zhuǎn)基因水稻為材料，從

3、主要代謝產(chǎn)物變化、相關(guān)酶活水平以及相關(guān)基因表達(dá)等方面進(jìn)行了分析，對NADH-GOGAT的生物學(xué)功能以及胞質(zhì)ICDH在提供2OG過程中的角色定位問題進(jìn)行了深入的探討。同時(shí)，本研究還對水稻氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(OsAAT)基因家族進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析，獲得了其中11個(gè)成員的T-DNA插入突變體，并對其碳氮含量進(jìn)行了初步分析。主要結(jié)果如下:
　　1.在粳稻中組成型表達(dá)OsNADH-GOGAT基因?qū)е翺sNADH-GOGAT1和<

4、br>　　OsNADH-GOGAT2的共抑制，OsFd-GOGAT1也下調(diào)表達(dá)。共抑制家系在正常營養(yǎng)供應(yīng)的田間表現(xiàn)為氮缺乏癥狀，如分蘗減少、株高變矮、產(chǎn)量和千粒重下降。代謝物檢測顯示，NADH-GOGAT共抑制家系葉片的可溶性糖、總氮以及多數(shù)含氮化合物含量下降，2OG、異檸檬酸和游離氨含量增加，部分碳氮代謝相關(guān)酶活也受到影響。這表明，NADH-GOGAT在水稻碳氮代謝的多個(gè)層面發(fā)揮著重要作用，是水稻氮素高效利用的關(guān)鍵基因;
　　2

5、.在粳稻中組成型表達(dá)OsICDH2導(dǎo)致共抑制，使OsICDH1和內(nèi)源OsICDH2表達(dá)量降低，葉片和根部ICDH酶活分別較野生型降低43.5％-76.6％和19.4％-56.4％。正常營養(yǎng)條件下，ICDH共抑制家系表現(xiàn)為生長量減少，田間產(chǎn)量降低，表明胞質(zhì)ICDH是保持水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要因子;
　　3.當(dāng)置于高溫下3-6天，ICDH共抑制家系幼苗逐漸失綠并最終死亡，而野生型表現(xiàn)正常。高溫下，與野生型比較，共抑制家系葉片中的葉綠素、多

6、種有機(jī)酸、可溶性糖、硝酸鹽含量降低，游離氨、總游離氨基酸、天冬酰胺和葡萄糖-6-磷酸含量增加，谷氨酸脫氫酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、果糖激酶和葡萄糖激酶活性上升，GS活性下降，OsGDH1和OsGDH2上調(diào)表達(dá)，OsGS2和OsFd-GOGAT1下調(diào)表達(dá)。我們推測，水稻IDH(NAD-依賴型異檸檬酸脫氫酶)和胞質(zhì)ICDH均可以為氮素的同化提供2OG，IDH是2OG的主要來源，胞質(zhì)ICDH僅在特殊條件下，如高溫脅迫期間，2