耐藥質粒RP4在不同微生物聚集體中水平轉移規(guī)律及其對氨氧化的影響.pdf

1、細菌耐藥性擴散以及耐藥基因的廣泛傳播嚴重威脅著人類健康。耐藥基因作為一類新型環(huán)境污染物，越來越引起研究者的廣泛關注。世界衛(wèi)生組織報告稱抗生素耐藥基因將會是本世紀威脅人類健康最重大的挑戰(zhàn)之一，甚至有報道預計2050年每年因耐藥菌感染死亡的人數(shù)將比現(xiàn)在癌癥患者還要多。污水生物處理系統(tǒng)作為水循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，其不僅是抗生素藥物進入環(huán)境的一個重要途徑，同時也是耐藥細菌、耐藥基因富集，并在環(huán)境中播散的一個重要污染源，生物處理系統(tǒng)中耐藥基因水平轉移問

2、題直接關系到環(huán)境生態(tài)安全。
　　污水生物處理系統(tǒng)過程復雜，由于工藝運行方式和反應器的構造不同，可以形成不同形態(tài)的微生物聚集體。課題構建好氧顆粒污泥生物反應系統(tǒng)(Granular Sludge Bioreactor,GSBR)，以系統(tǒng)中不同形態(tài)微生物聚集體為研究對象，將粒徑(D)小于0.18mm定義為絮狀污泥，顆粒污泥分為三個粒徑范圍：小粒徑顆粒污泥(0.18mm＜D＜0.45mm)，中等粒徑顆粒污泥(0.45mm＜D＜0.9mm)

3、與大粒徑顆粒污泥(D>0.9mm)。采用攜帶具有廣泛宿主RP4質粒的E.coli K12(RP4)為供體菌，進行一次性高濃度E.coli K12(RP4)投加，利用實時熒光定量PCR技術追蹤RP4質粒在不同形態(tài)微生物聚集體中的分布變化，探討耐藥基因在不同微生物聚集體中水平轉移規(guī)律。結果顯示，第8d投加供體菌E.coli K12(RP4)后，GSBR中各粒徑污泥比例出現(xiàn)波動，第18d后重新達到動態(tài)平衡。其中大粒徑顆粒污泥占總污泥比例70％

4、以上，是GSBR中主要微生物聚集體形態(tài)。投加供體菌后，因E.coli K12(RP4)被淘洗出GSBR，RP4質粒不斷減少。RP4質粒的豐度隨污泥粒徑增大而降低，其中豐度最高的為絮狀污泥，投加供體菌后絮狀污泥中RP4質粒豐度達到8.10×10-2，4d后降低至4.14×10-6。豐度最低的為大粒徑顆粒污泥，投加供體菌后大粒徑顆粒污泥中RP4質粒豐度為1.43×10-3，4d后降低至1.42×10-8。RP4質粒在大粒徑、中等粒徑、小粒徑

5、顆粒污泥中存留時間分別為7d，14d和13d。第13d后RP4質粒在絮狀污泥中的豐度穩(wěn)定維持在1.2×10-6-1.6×10-6之間，直至第26d后檢測為陰性。由此可得出以下結論：RP4質粒在不同微生物聚集體中的水平轉移效率不同，污泥粒徑越大，RP4質粒的水平轉移效率越低。相比于絮狀污泥，好氧顆粒污泥系統(tǒng)能降低耐藥基因在污泥中的水平轉移，可有效控制耐藥基因傳播和擴散的生態(tài)風險。在無抗生素選擇壓力下，耐藥基因在絮狀污泥中存留時間長，依然會

6、對生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，表明耐藥基因的傳播范圍已經(jīng)超過了抗生素的污染范圍?？刂颇退幓虻臄U散，一方面需規(guī)范抗生素的使用，另一方面需要有效控制耐藥基因的轉移和傳播。
　　硝化反應在自然界的氮循環(huán)中起著重要作用，同時也是污水系統(tǒng)生物脫氮的關鍵反應，其包含了氨氧化細菌(Ammonia-oxidizing Bacteria, AOB)進行的氨氧化作用和亞硝酸鹽氧化細菌(Nitrite-oxidizing Bacteria,NOB)進行的亞硝酸

7、鹽氧化作用。AOB是硝化菌群的重要組成部分，氨氧化代謝反應也是生物硝化過程中限速步驟和最為敏感的反應之一。耐藥基因作為生物大分子，可直接參與細菌代謝，甚至影響、改變生物代謝過程，進而直接影響污水生物處理系統(tǒng)的污染物去除效率。課題分別以GSBR和以自養(yǎng)硝化菌為主體的硝化污泥生物反應系統(tǒng)(Nitrification Sludge Bioreactor,NSBR)為研究對象，采用供體菌E.coli K12(RP4)不同投加方法，觀察GSBR與

8、 NSBR系統(tǒng)中氨氮去除率的變化以及典型周期內氨氮去除效果，利用培養(yǎng)計數(shù)法和實時熒光定量PCR技術對供體菌和RP4質粒進行計數(shù)和定量追蹤，采用變性梯度凝膠電泳技術(PCR-DGGE)對污泥中 AOB菌群結構多樣性進行觀察，對DGGE圖譜中主要優(yōu)勢條帶進行切膠測序，將測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對和鑒定，采用MEGA軟件建立進化樹進行AOB菌群同源性分析。同時利用實時熒光定量PCR技術對AOB菌群豐度進行分析，分別針對不同系統(tǒng)中

9、耐藥基因水平轉移對氨氮去除效率影響，氨氧化菌群變化以及代謝活性影響機制進行研究。研究結果表明，GSBR系統(tǒng)中一次性投加高濃度供體菌E.coli K12(RP4)對COD、氨氮的去除效果均有影響，但對氨氮去除的影響更加明顯。第8d投加E.coli K12(RP4)后，氨氮去除效果下降，第9d氨氮去除率最低為32.8%，隨后氨氮去除率恢復緩慢，直至第19d恢復至投加供體菌前水平。GSBR中大粒徑和中等粒徑顆粒污泥優(yōu)勢AOB菌群穩(wěn)定，絮狀污泥

10、和小粒徑顆粒污泥優(yōu)勢AOB發(fā)生了演變，但優(yōu)勢AOB為亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)以及與其同源性較高的菌群，因此認為GSBR中AOB菌群結構穩(wěn)定。投加E.coli K12(RP4)后，GSBR中各粒徑污泥AOB菌群豐度較為穩(wěn)定，反應器運行后期絮狀污泥和小粒徑顆粒污泥AOB出現(xiàn)增長。RP4質粒影響了AOB的代謝活性，隨著GSBR中RP4質粒的減少，AOB代謝活性逐漸恢復，新生AOB增長，GSBR氨氧化作用恢復。NSBR系統(tǒng)中，連

11、續(xù)投加低濃度與高濃度E.coli K12(RP4)時，供體菌E.coli K12(RP4)并沒有因連續(xù)投加而在NSBR中定植與生長，并且數(shù)量不斷減少，RP4質粒在總細菌中仍維持穩(wěn)定的比例，因此RP4質粒發(fā)生了由異養(yǎng)供體菌向自養(yǎng)硝化菌的水平轉移。連續(xù)投加低濃度 E.coli K12(RP4)時，氨氮降解速率減慢，氨氧化能力受到影響，而亞硝酸鹽氧化能力未受其影響。連續(xù)投加高濃度E.coli K12(RP4)時，氨氮去除效果持續(xù)下降至50%-