咪唑類離子液體側(cè)鏈烷基鏈長度對RP4質(zhì)粒介導(dǎo)的抗性基因水平轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、抗生素抗性基因在全球范圍內(nèi)的傳播擴(kuò)散和對環(huán)境產(chǎn)生的風(fēng)險已經(jīng)成為國際關(guān)注的熱點，抗性基因作為一類新型環(huán)境污染物，在環(huán)境中的傳播擴(kuò)散可能比抗生素本身所產(chǎn)生的環(huán)境風(fēng)險和危害更大。水平基因轉(zhuǎn)移在抗性基因的擴(kuò)散傳播過程中發(fā)揮著重要作用，質(zhì)粒是細(xì)菌間進(jìn)行基因水平轉(zhuǎn)移的主要載體。本文的研究重點就是 RP4質(zhì)粒介導(dǎo)的抗性基因水平轉(zhuǎn)移。自然水環(huán)境中含有大量的抗性細(xì)菌，是基因水平轉(zhuǎn)移實驗中媒介的最佳選項。
　　作為“環(huán)境友好型”溶劑，離子液體因其極低

2、的蒸汽壓，良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性和很寬的液態(tài)范圍，被認(rèn)為是傳統(tǒng)有機溶劑的替代物，近幾年來被廣泛應(yīng)用在化工、電子等領(lǐng)域。然則，很少有研究涉及離子液體環(huán)境、生態(tài)毒性的研究，潛在的環(huán)境影響數(shù)據(jù)也是少之又少。
　　本課題主要針對三種不同側(cè)鏈取代基長度的咪唑類離子液體1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[CnMIM][BF4], n=4,6,8）對RP4質(zhì)粒介導(dǎo)的抗性基因水平轉(zhuǎn)移的影響，及對環(huán)境細(xì)菌中的抗性基因傳播擴(kuò)散能力的研究。分別進(jìn)行

3、了實驗室純菌培養(yǎng)體系和自然水體環(huán)境模擬實驗，兩種實驗中的供體菌均為攜帶有RP4質(zhì)粒（可以編碼卡那霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素三種抗性）的大腸桿菌（E.coli DH5α）。純菌培養(yǎng)體系中的受體菌為沙門氏菌，具有編碼鏈霉素抗性的基因，而不具有供體菌攜帶的三種抗性（跨屬）。自然水環(huán)境模擬實驗中的受體菌為水樣中的全部菌群。對自然水環(huán)境模擬實驗樣品中的16S rRNA，sul1, int1, aphA（RP4質(zhì)粒攜帶的編碼卡那霉素抗性的基因）和tr

4、aF（RP4上的指示基因）基因進(jìn)行了定量。這是首次對離子液體的不同結(jié)構(gòu)對抗性基因水平轉(zhuǎn)移造成的影響進(jìn)行探討的研究。
　　實驗結(jié)果表明，以上兩種模擬實驗中一定濃度的咪唑類離子液體均能夠提高 RP4質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移頻率。與空白對照組相比，兩種模擬體系中，咪唑類離子液體對 RP4質(zhì)粒介導(dǎo)的抗性基因水平轉(zhuǎn)移頻率的影響均表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)和結(jié)構(gòu)效應(yīng)關(guān)系。劑量效應(yīng)關(guān)系指的是在一定的濃度范圍內(nèi)，基因水平轉(zhuǎn)移頻率隨著離子液體濃度的升高而增大，而當(dāng)

5、離子液體大于某個濃度，水平轉(zhuǎn)移頻率隨之下降。以自然水環(huán)境為例，當(dāng)[BMIM][BF4]的濃度大于1.0（或2.5） g/L或[HMIM][BF4]的濃度大于0.1g/L或[OMIM][BF4]的濃度大于0.001 g/L時RP4水平轉(zhuǎn)移頻率下降。結(jié)構(gòu)效應(yīng)關(guān)系是指不同結(jié)構(gòu)的離子液體所能造成的抗性基因水平轉(zhuǎn)移頻率的最大值不同，表現(xiàn)為抗性基因水平轉(zhuǎn)移頻率隨著[CnMIM][BF4]碳鏈取代基的增長而減?。╪=4,6,8），呈現(xiàn)出BMIM][B

6、F4](n=4)>[HMIM][BF4](n=6)>[OMIM][BF4](n=8)的規(guī)律。以自然水環(huán)境為例，[BMIM][BF4]最大能促進(jìn)轉(zhuǎn)移頻率提高13.6倍；[HMIM][BF4]為7.0倍；[OMIM][BF4]3.2倍。
　　與空白對照組相比，純菌培養(yǎng)體系中，不同結(jié)構(gòu)的咪唑類離子液體對細(xì)菌生長（OD600）的影響也表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)和結(jié)構(gòu)效應(yīng)關(guān)系。但是兩種曲線當(dāng)[CnMIM][BF4]的濃度達(dá)到可以導(dǎo)致最大RP4水平

7、轉(zhuǎn)移頻率時，離子液體對細(xì)菌生長不會產(chǎn)生抑制作用，如0.1 g/L的[BMIM][BF4]能促進(jìn)轉(zhuǎn)移頻率達(dá)到最大，而1.0 g/L的[BMIM][BF4]仍不會影響細(xì)菌生長。說明在環(huán)境中離子液體的誘導(dǎo)之下抗性基因會進(jìn)行大量的水平轉(zhuǎn)移，而細(xì)菌生長不會受到抑制。流式細(xì)胞儀檢測了不同結(jié)構(gòu)的離子液體對細(xì)胞膜通透性的影響，三種離子液體在各自導(dǎo)致基因最大水平轉(zhuǎn)移頻率的濃度下，對細(xì)胞膜通透性的破壞呈現(xiàn)[BMIM][BF4]>[HMIM][BF4]>[O