兩種用于CR檢ISPR-Cas9靶效應和脫靶效應測新方法的建立.pdf

1、目的：建立基于藍白篩選技術進行評估CRISPR/Cas9酶活性的方法；使用此方法評估CRISPR/Cas9基因編輯的靶效應和脫靶效應。
　　方法：人工構建基于藍白斑篩選的含有CRISPR/Cas9靶序列的報告質(zhì)粒，通過菌落產(chǎn)生的藍變白與白變藍兩種不同變化，建立在原核水平檢測CRISPR/Cas9靶效應和脫靶效應的有效方法體系。在藍變白實驗中，將包括與gRNA完全互補的靶序列，PAM位點突變的靶序列，PAM位點旁1到19位點堿基連續(xù)

2、突變的靶序列等一系列基因片段亞克隆至PMD-19T質(zhì)粒的lacZ基因起始密碼子后，并保持基因閱讀框不發(fā)生移碼,其轉(zhuǎn)入大腸桿菌后對應的菌落顏色為藍色。再將相應的gRNA克隆至原核CRISPR/Cas9質(zhì)粒上，共同轉(zhuǎn)化構建成功的CRISPR/Cas9和含有對應靶點的PMD-19T質(zhì)粒將會導致菌落顏色發(fā)生變化。我們初步通過這種顏色的變化來直觀地判斷是否發(fā)生CRISPR/Cas9剪切作用，后續(xù)通過溶菌實驗以及熒光定量PCR實驗來計算剪切量的多少

3、，從而有效地評估CRISPR/Cas9剪切的靶效應和脫靶效應。在白變藍的實驗中，建立了三種用于核酸酶活性檢測的含有雙重復片段載體。將雙重復片段載體與藍白斑篩選相結(jié)合，待測靶序列和重復片段均位于α-多肽基因編碼序列之內(nèi)，并且預先設計使編碼框架發(fā)生移碼效果，這樣的載體自身轉(zhuǎn)化得到的大腸桿菌表現(xiàn)為白色。同時，載體構建時設計的重復片段之間發(fā)生重組反應后能使基因閱讀框架恢復為不移碼的狀態(tài)。這樣，當共轉(zhuǎn)化CRISPR/Cas9使靶序列發(fā)生剪切后,導

4、致在大腸桿菌內(nèi)發(fā)生重復片段的重新組合，可形成一部分藍色的菌落斑。藍色菌落斑的形成，驗證了藍變白實驗中CRISPR/Cas9剪切的發(fā)生。藍色菌落斑的多少，與核酸酶的剪切活力的大小相關，由此確定CRISPR/Cas9是否對靶序列發(fā)生了剪切以及剪切量的多少。同樣地，我們也對重復片段中間的靶序列的不同位點進行單堿基突變，通過觀察共轉(zhuǎn)后生成的藍菌和白菌的不同的比例，來研究CRISPR/Cas9剪切的靶效應和脫靶效應。靶序列與gRNA完全互補時，檢

5、測靶效應；靶序列與gRNA不完全互補時，則該技術用于檢測脫靶效應。
　　結(jié)果：藍變白實驗中，原核系統(tǒng)中均可實現(xiàn)gRNA與靶點序列堿基完全互補時，CRISPR/Cas9剪切靶點序列后菌落呈白色；當gRNA與靶點序列堿基完全不互補時，剪切后菌落呈藍色；當檢測連續(xù)錯配單堿基的靶序列，所產(chǎn)生菌落則為不同程度的藍色菌落，總體趨勢為：突變位點越靠近PAM位點，在CRISPR/Cas9剪切后，則菌落的藍色越深；越遠離PAM位點，菌落藍色越淡甚至

6、趨于白色。后續(xù)通過溶菌實驗和熒光定量PCR對CRISPR/Cas9剪切后的菌落進行定量分析同樣解釋了此現(xiàn)象，再次確定CRISPR/Cas9的剪切效率非百分之百，采用本方法成功對不同條件下CRISPR/Cas9剪切的靶效應和脫靶效應進行定量。剪切后的菌落藍色越深，表明被CRISPR/Cas9剪切的靶序列越少，脫靶效應越低；剪切后的菌落藍色越淺，則被剪切的靶序列越多，脫靶效應越高。在白變藍實驗中，構建的雙重復片段載體的報告質(zhì)粒使其LacZ閱

7、讀框移碼，得到的大腸桿菌表現(xiàn)為白色。當待測靶序列受到CRISPR/Cas9的編輯時，通過實驗的預先設計使菌落再次變?yōu)樗{色。當突變重復片段之間靶點的單堿基時，突變不同的位點對生成的藍白菌的比例也有影響,總體趨勢為gRNA與靶點序列堿基完全互補時，重復片段修復的效率最高；當對靶序列單堿基突變后，修復效率大大降低，但也有個別位點不受突變的影響。并且不同的雙重復片段載體修復的效率不同，HBV病毒重復片段和含有噬菌體LoxP重復片段的載體效率較人