基于多種信標(biāo)物質(zhì)的Signal-on電化學(xué)生物傳感器的研究.pdf

1、電化學(xué)生物傳感器具有簡單、成本低、靈敏度高等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品分析和病原微生物研究等領(lǐng)域。在電化學(xué)生物傳感器研究構(gòu)建時(shí)，利用多功能的納米材料和高效的信號(hào)放大策略改善電化學(xué)生物傳感器的各項(xiàng)性能，這些新方法和新技術(shù)的研發(fā)，對(duì)各種生物分子特異、靈敏的檢測具有十分重要的科學(xué)意義和使用價(jià)值。本論文設(shè)計(jì)多種引入信標(biāo)物質(zhì)的方法，結(jié)合多種信號(hào)放大策略和多功能化納米材料，分別制備了高通量、高靈敏、操作簡便及生物相容性好的幾種電化學(xué)生

2、物傳感器。具體的工作如下：
　　1．結(jié)合多標(biāo)記多組分檢測策略和設(shè)計(jì)新的陣列電極構(gòu)建高通量電化學(xué)免疫傳感器的研究
　　多標(biāo)記策略可以實(shí)現(xiàn)傳感器同一界面的多組分同時(shí)測定，但是這種方法受到了標(biāo)記電活性物質(zhì)數(shù)量的限制，從而限制了傳感器的檢測通量。為了提高傳感器的檢測通量，本研究將多標(biāo)記多組分檢測策略與陣列電極多組分檢測方法相結(jié)合，構(gòu)建了高通量電化學(xué)免疫傳感器，達(dá)到同時(shí)對(duì)肝癌六種標(biāo)志物的檢測。在本研究中，新設(shè)計(jì)的陣列電極由三個(gè)檢測點(diǎn)和

3、一個(gè)對(duì)照檢測點(diǎn)組成。首先，在每一個(gè)檢測點(diǎn)上同時(shí)固載兩種不同抗原的一抗，所對(duì)應(yīng)的二抗分別標(biāo)記了兩種具有不同氧化還原電位的電活性物質(zhì)。在夾心免疫反應(yīng)作用下，可以通過兩種電活性物質(zhì)電流峰位置的不同和峰值大小對(duì)兩種抗原的濃度進(jìn)行定量。由此，在一個(gè)電極上，三個(gè)分析檢測點(diǎn)可以同時(shí)完成六種生物標(biāo)志物的檢測，與此同時(shí)，對(duì)照檢測點(diǎn)可以完成空白對(duì)照的測定。另外，為了提高了傳感器檢測的靈敏度，合成了PtPd雙金屬/石墨烯納米片（PtPd-GS）用來固載二抗和

4、辣根過氧化物酶（HRP），利用PtPd-GS和HRP的協(xié)同催化作用來增強(qiáng)電流信號(hào)。該方法與傳統(tǒng)陣列分析（每個(gè)檢測點(diǎn)上檢測一種蛋白），檢測通量增加了一倍。根據(jù)這種檢測模型，若在同一檢測點(diǎn)上同時(shí)檢測三種或四種目標(biāo)物，那么傳感器的檢測通量可以增加三倍以上。本研究所構(gòu)建的檢測模型將是一個(gè)新高通量分析物測定的模型。
　　2．高效蛋白轉(zhuǎn)化策略用于對(duì)胱抑素C的電化學(xué)靈敏檢測
　　目前，抗體依然是蛋白質(zhì)檢測中最主要的識(shí)別元件。然而，抗體作為

5、識(shí)別元件大大增加了核酸技術(shù)在蛋白質(zhì)檢測中的應(yīng)用難度。本研究結(jié)合夾心免疫反應(yīng)，鄰位觸及反應(yīng)和酶剪切目標(biāo)循環(huán)策略設(shè)計(jì)了一個(gè)蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)換體系，將蛋白質(zhì)的檢測轉(zhuǎn)換為DNA的測定，在進(jìn)行DNA測定時(shí)，再引入了將雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR），從而成功的將HCR應(yīng)用到蛋白質(zhì)檢測當(dāng)中。在該蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換體系中，一個(gè)目標(biāo)物（如胱抑素C）的輸入可以轉(zhuǎn)換為多個(gè)單鏈DNA的輸出，從而提高了蛋白質(zhì)檢測的靈敏度。同時(shí)，輸出的單鏈DNA再作為引發(fā)DNA在電極表面引發(fā)HCR，

6、使電極表面產(chǎn)生大量的雙鏈DNA聚合物，最后通過雙鏈DNA聚合物和電活性物質(zhì)硫堇（Thi）之間的靜電吸附的作用，將大量的Thi固載到電極表面，從而輸出可測的電化學(xué)信號(hào)。通過電極表面的HCR放大技術(shù)，進(jìn)一步的提高了蛋白質(zhì)檢測的靈敏度。通過以上設(shè)計(jì)，成功的將酶剪切目標(biāo)物循環(huán)和HCR兩種核酸技術(shù)應(yīng)用在蛋白質(zhì)檢測當(dāng)中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法切實(shí)可行，具有檢測限低、選擇性好等特點(diǎn)。
　　3. Cu、Mn雙摻雜的二氧化鈰納米球作為信號(hào)標(biāo)簽和信號(hào)放大

7、器構(gòu)建的信號(hào)增強(qiáng)型電化學(xué)生物傳感器
　　電化學(xué)生物傳感器構(gòu)建中電信號(hào)的來源主要是依賴于具有電化學(xué)活性染料小分子。對(duì)納米材料自身作為信號(hào)標(biāo)簽的關(guān)注還比較少。本研究合成了Cu、Mn雙摻雜的二氧化鈰納米球（CuMn-CeO2）作為信號(hào)標(biāo)簽、載體和催化劑構(gòu)建了電化學(xué)免疫傳感器用于對(duì)降鈣素原（PCT）的測定。通過Cu、Mn雙摻雜的作用，改善了CeO2本身的電化學(xué)性能，使傳感器的電流信號(hào)直接來源于CuMn-CeO2，不需要再引入額外的電活性物

8、質(zhì)作為標(biāo)簽。同時(shí)，由于CuMn-CeO2對(duì)H2O2的氧化具有良好的催化作用，在測試底液中加入H2O2時(shí)，二抗生物耦合物中的CuMn-CeO2會(huì)催化H2O2氧化的同時(shí)促進(jìn)Ce3+/Ce4+之間的電子傳輸，從而增強(qiáng)了電流信號(hào)，提高了檢測的靈敏度。此外，CuMn-CeO2不需要再經(jīng)過其他的化學(xué)修飾就可直接作為載體固載PCT第二抗體。在該研究中，CuMn-CeO2這種納米材料同時(shí)作為信號(hào)標(biāo)簽、載體和信號(hào)放大器，大大地簡化了傳感器的構(gòu)建步驟。本研

9、究成功地利用納米材料作為電活性物質(zhì)來構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，拓展了納米材料的應(yīng)用范圍。
　　4.基于堿性磷酸酯酶和Hemin/G-四分體催化氧化1-萘酚構(gòu)建的信號(hào)放大型凝血酶適體傳感器的研究
　　文獻(xiàn)報(bào)道堿性磷酸酯酶是一類可以催化不具有電化學(xué)活性的底物水解生成具有電化學(xué)活性的物質(zhì)的生物酶。由此，堿性磷酸酯酶廣泛應(yīng)用在構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器當(dāng)中。同時(shí)，這類傳感器還結(jié)合了化學(xué)氧化還原循環(huán)放大策略來增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)去提高檢測的靈敏度。這

10、種信號(hào)放大策略是通過向測試底液中加入的強(qiáng)還原劑得以實(shí)現(xiàn)，但是，強(qiáng)還原劑的引入會(huì)致使堿性磷酸酯酶和生物分子的活性在一定程度上受到影響。本研究提出利用生物相容性好的Hemin/G-四分體作為催化劑，在H2O2存在的情況下，直接高效地催化氧化在電極表面原位產(chǎn)生的電活性物質(zhì)1-萘酚來構(gòu)建信號(hào)放大型電化學(xué)凝血酶適體傳感器。在該傳感器中，首先利用堿性磷酸酯酶催化水解1-萘酚磷酸酯，在電極表面原位產(chǎn)生了電活性物質(zhì)1-萘酚，從而輸出一個(gè)可測量的電化學(xué)信

11、號(hào)。在加入H2O2后，Hemin/G-四分體會(huì)高效催化氧化1-萘酚，從而使輸出的電流密度增加。為了進(jìn)一步增強(qiáng)輸出電流，將具有良好導(dǎo)電性的Au納米修飾的ZnO納米花作為載體用于增加生物分子的固載量，為電子傳輸提供良好的微環(huán)境。本研究探究了Hemin/G-四分體的新的催化活性，同時(shí)為基于堿性磷酸酯酶的電化學(xué)傳感器提供了新的信號(hào)放大策略。
　　5.基于DNA水凝膠和pH刺激信號(hào)放大構(gòu)建的電化學(xué)阻抗傳感器的研究
　　電化學(xué)阻抗傳感器

12、一般是基于目標(biāo)物自身阻礙電子傳遞所引起的阻抗變化來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定量測定，其靈敏度較低。若目標(biāo)物能夠引發(fā)生成一些對(duì)電子傳遞具有更強(qiáng)的阻礙作用的物質(zhì)生成，從而能夠顯著提高檢測靈敏度。本研究通過目標(biāo)物誘導(dǎo)形成對(duì)電子傳遞阻礙作用更強(qiáng)的水凝膠生成，再結(jié)合pH刺激增加水凝膠密度的方式來放大阻抗信號(hào)，構(gòu)建了信號(hào)放大型阻抗傳感器用于對(duì)乙酰肝素酶（HPA）的電化學(xué)檢測。首先，在有目標(biāo)物HPA存在時(shí)，HPA將引發(fā) DNA雜交從而在電極表面上形成水凝膠，同時(shí)