溶藻菌分離鑒定、溶藻特性及作用機理研究.pdf

1、近年來，我國近岸海域、湖庫水體污染嚴重，富營養(yǎng)化程度加劇，赤潮水華頻發(fā)且影響范圍擴大，探索行之有效的抑藻控藻技術(shù)尤為重要。微生物控藻技術(shù)具有高效、成本低、二次污染風險低等特點，已成為近年來水體富營養(yǎng)化治理的研究熱點。論文以我國發(fā)生頻率高、分布范圍廣的淡水水華藍藻銅綠微囊藻為研究對象，從浙江省富營養(yǎng)化水體篩選分離獲得具有溶藻特性的微生物，在此基礎(chǔ)上開展溶藻菌分子鑒定與生理生化特性、溶藻菌發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化、溶藻產(chǎn)物特性與生物急性毒性

2、、溶藻過程作用機理以及環(huán)境水體除藻及脫氮性能等研究，取得以下結(jié)果:
　　 1.從富營養(yǎng)化水體中分離篩選獲得4株具有高效抑藻作用的溶藻菌HJC-D1、ZJG-24、ZJG-215和KY-63，菌株HJC-D1抑藻效果最佳，結(jié)合形態(tài)學、生理生化特征及16S rRNA序列分析，將其鑒定為鏈霉菌屬Streptomyces sp.HJC-D1;溶藻菌HJC-D1發(fā)酵培養(yǎng)4d后，在銅綠微囊藻初始葉綠素a初始濃度0.2713±0.0192～0

3、.6375±0.0321 mg·L-1時，葉綠素a去除率為53.5±4.3％～62.6±3.3％;溶藻菌Streptomyces sp.HJC-D1溶藻活性物質(zhì)主要存在于胞外無菌濾液中，并具有熱穩(wěn)定性、嗜堿性，可被乙酸乙酯萃取，推測其作用方式為間接抑藻?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，為優(yōu)化溶藻菌Streptomyces sp.HJC-D1大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)溶藻活性物質(zhì)的培養(yǎng)條件，通過單因素實驗篩選，獲得溶藻菌Streptomyces sp.HJC-D1發(fā)

4、酵培養(yǎng)基的最佳碳氮源為蔗糖和硝酸鉀，并采用PB實驗設(shè)計獲得影響溶藻菌抑藻活性的三種顯著因素為蔗糖、硝酸鉀和初始pH值;在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用CCD響應(yīng)曲面法分析獲得溶藻菌Streptomyces sp.HJC-D1的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基為(g·L-1):蔗糖，22.73; KNO3,0.96; NaCl,0.5; K2HPO4,0.5; MgSO4,0.5;FeSO4，0.002，初始pH為8.8;在溶藻菌Streptomyces sp.HJC-D

5、1發(fā)酵條件優(yōu)化方面，研究了培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量和初始pH值等參數(shù)對發(fā)酵工藝的影響，確定各因素的最佳條件為:培養(yǎng)溫度33.1℃、搖床轉(zhuǎn)速337.5 rpm、裝液量91.2 mL/250 mL搖瓶、初始pH11.8，在此條件下培養(yǎng)4d后，藻葉綠素a去除率高達93.7％。
　　 2.運用傅里葉紅外光譜、三維熒光光譜、凝膠滲透色譜等技術(shù)，研究了溶藻菌Streptomyces sp.HJC-D1抑制銅綠微囊藻過程中溶藻產(chǎn)物的組成與特

6、性。結(jié)果表明，投加比例為3％(v/v)時溶藻菌Streptomyces sp.HJC-D1發(fā)酵液能有效抑制初始葉綠素a含量為0.2835±0.0721 mg·L-1銅綠微囊藻生長，培養(yǎng)8d后藻類去除率為46.8±5.1％;在5％和10％投加比例下，藻類去除率可達72.6±5.5％和82.8±1.8％。不同處理組溶藻產(chǎn)物的DOM光譜學特性研究發(fā)現(xiàn)，溶藻產(chǎn)物分子量約1000 Da，其DOM組分熒光峰特征基本相似，DOM以類腐殖酸物質(zhì)為主，且

7、隨溶藻菌發(fā)酵液濃度增加，溶藻產(chǎn)物DOM中類腐殖酸和類富里酸熒光物質(zhì)的強度總體呈增大趨勢。傅里葉紅外分析發(fā)現(xiàn)，溶藻產(chǎn)物HPI和HPO-A組分紅外吸收峰位置與峰形大致相似，但各吸收峰的相對強度有所差異，TPI-A在1031cm-1處的特征峰則是由糖類和多糖類物質(zhì)的伸縮振動引起;應(yīng)用發(fā)光細菌(Photobacterium phosphoreum)急性毒性試驗研究了溶藻產(chǎn)物的生物急性毒性，發(fā)現(xiàn)溶藻菌發(fā)酵液本身對發(fā)光細菌具有一定的低毒性，發(fā)酵3～

8、5 d時相對發(fā)光度為67.6±3.1％～72.4±2.8％;以微囊藻毒素為主要溶藻產(chǎn)物進行毒性試驗發(fā)現(xiàn)，水體藻毒素濃度低于20μg·L-1時其生物毒性較低。
　　 3.通過對功能菌株抑制前后銅綠微囊藻細胞完整性和生理特征、抗氧化酶活、氧化損傷變化的影響研究，初步揭示了溶藻菌Streptomyces sp.HJC-D1對銅綠微囊藻的溶藻機制。結(jié)果表明，銅綠微囊藻的生長抑制程度和活藻細胞比例隨發(fā)酵液濃度和共培養(yǎng)時間變化，共培養(yǎng)8d時

9、3％、5％和10％處理組中活藻細胞含量分別為51.4％、15.7％和2.3％，TEM鏡檢發(fā)現(xiàn)藻細胞壁受到大幅破壞，細胞膜通透性增大，胞內(nèi)K+和Ca2+離子外滲;在溶藻菌無菌濾液脅迫下，銅綠微囊藻抗氧化酶活發(fā)生明顯變化，SOD、POD和CAT酶活隨發(fā)酵液濃度的增加而增加，活性氧ROS水平亦顯著提升，其過量增加導致藻細胞氧化損傷、細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而破壞細胞質(zhì)膜，導致藻細胞破裂;綜上分析，推測溶藻菌Streptomyces sp.HJ

10、C-D1抑制銅綠徼囊藻細胞生長的溶藻機理為:溶藻菌破壞藻細胞壁，導致細胞內(nèi)類囊體、光合片層、磷酸顆粒等細胞器釋放并失活，最終引起藻細胞衰亡。
　　 4.針對我國環(huán)境水體富營養(yǎng)化日趨嚴重、藻類污染頻發(fā)等問題，應(yīng)用分離獲得的溶藻菌Streptomyces sp.HJC-D1開展固定化微生物技術(shù)強化污染水體生物膜除藻及脫氮性能研究。結(jié)果表明，對照組和試驗組的水體葉綠素a平均去除率分別為71.7±5.4％和80.9±4.4％，NH4+-

11、N的平均去除率為77.8±2.8％和72.4±3.2％，而高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)平均去除率為25.0±1.5％和18.7±1.4％;不同曝氣強度研究發(fā)現(xiàn)，曝氣/停曝時間比2h∶4h、曝氣量60 L·h-1工況下，系統(tǒng)CODMn和NH4+-N去除率均有所提高，相比對照組NO3-N積累更為明顯;水力停留時間(HRT)變化對系統(tǒng)NH4+-N、CODMn等的去除影響不大，但縮短HRT時葉綠素a去除率有所降低;分析填料表面微生物相發(fā)現(xiàn)，試驗組