益氣活血解毒方調(diào)控Tregs相關(guān)SNPs位點(diǎn)治療氣虛血瘀型晚期卵巢癌的研究.pdf

1、由于卵巢癌的早期癥狀不明顯且缺乏特異性，其早期診斷的技術(shù)也一直未見(jiàn)提高，患者發(fā)現(xiàn)時(shí)一般已處于晚期階段，雖然對(duì)其治療方法一直在探索，其標(biāo)準(zhǔn)治療手術(shù)加化療的方案也一直在精進(jìn)，但其效果差強(qiáng)人意，尚未取得令人滿意的療效，而且該病發(fā)病后容易復(fù)發(fā)，故卵巢癌一直是女性健康的一大殺手。臨床數(shù)據(jù)顯示約70％的卵巢癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，但是目前，行最大程度的滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類(lèi)與紫杉醇類(lèi)藥物的一線化療方案仍為其標(biāo)準(zhǔn)治療。近幾十年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的

2、不斷進(jìn)步、發(fā)展以及化療藥物的發(fā)現(xiàn)和使用，手術(shù)和化療已經(jīng)有了很大的進(jìn)步，但據(jù)美國(guó)流行病學(xué)和數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，近三十年來(lái)晚期卵巢癌的5年生存率仍未見(jiàn)明顯的改善、提高。近年來(lái)，中醫(yī)藥對(duì)于卵巢癌患者的治療得到了人們的關(guān)注，無(wú)論是在延長(zhǎng)患者的無(wú)進(jìn)展生存期、提高患者的生活質(zhì)量、改善放化療產(chǎn)生的副反應(yīng)方面都得到了大家的認(rèn)可。經(jīng)過(guò)前期臨床研究我們發(fā)現(xiàn):晚期卵巢癌患者的中醫(yī)臨床證型以氣虛證和血瘀證等證為主要證型。故我的導(dǎo)師盧雯平教授針對(duì)該類(lèi)型的患者運(yùn)用自擬益氣

3、活血解毒方進(jìn)行臨床辨證治療，該方是在近現(xiàn)代名中醫(yī)張錫純用以治療婦科腫瘤名方“理沖湯”的基礎(chǔ)之上，結(jié)合我科名老中醫(yī)孫桂芝教授、樸炳奎教授的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行加減而成的有效的抗腫瘤驗(yàn)方，主要的藥物組成是:黃芪、山藥、白術(shù)、枸杞子、女貞子、莪術(shù)、三棱、青皮、海藻、青蒿、白花蛇舌草、穿山甲、全蟲(chóng)，黃芪補(bǔ)氣力量最強(qiáng)，效果最好，為方中益氣主要藥物，山藥、白術(shù)健脾氣，升清氣，培補(bǔ)后天之氣，故而能夠從根本上調(diào)節(jié)人體氣的生成，同時(shí)達(dá)到治病必求于本的目的。氣為血之帥

4、，血為氣之母，補(bǔ)氣的同時(shí)也要注重補(bǔ)人體之精血，使得氣血相和，不致偏頗，故加入枸杞子、女貞子等補(bǔ)血養(yǎng)精之品。莪術(shù)、三棱、青皮、海藻、穿山甲、全蟲(chóng)等物具有活血行氣、軟堅(jiān)散結(jié)之功能，益氣的同時(shí)注重活血行氣。青蒿、白花蛇舌草則以清熱解毒為主要功用。綜上所述，理沖湯消補(bǔ)兼施，扶正祛瘀，加入蟲(chóng)類(lèi)藥取其久病入絡(luò)，增加活血通絡(luò)散結(jié)之力，加一些清化之品白花蛇舌草、青蒿取其本病日久易化熱化火傷津之意。Tregs細(xì)胞是現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)對(duì)卵巢癌研究的新視角，現(xiàn)代研

5、究發(fā)現(xiàn)腫瘤的病理機(jī)制多與免疫系統(tǒng)相關(guān)，而Tregs細(xì)胞就是免疫系統(tǒng)中與免疫相關(guān)的重要一環(huán)。免疫治療被認(rèn)為是突破現(xiàn)有治療的最有希望療法，但腫瘤微環(huán)境中復(fù)雜的免疫抑制分子機(jī)制及缺乏對(duì)卵巢癌個(gè)體免疫差異的認(rèn)識(shí)，使得其在臨床未取得明顯進(jìn)展。最新研究表明，調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Tregs)是卵巢癌腫瘤微環(huán)境復(fù)雜免疫網(wǎng)絡(luò)中調(diào)控免疫逃逸和血管生成的關(guān)鍵免疫抑制因子，其相關(guān)基因的多態(tài)性(SNPs)與卵巢癌預(yù)后密切相關(guān)，研究Tregs細(xì)胞的發(fā)生機(jī)制與卵巢癌的關(guān)系對(duì)

6、臨床制定卵巢癌的治療方案具有積極作用。CD24參與細(xì)胞的粘附和轉(zhuǎn)移，被證實(shí)是血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附受體，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞在血液中的轉(zhuǎn)移，被認(rèn)為是一種新的致癌因子，也是腫瘤診斷和預(yù)后的重要標(biāo)志，且有相關(guān)研究表明CD24與Tregs發(fā)揮免疫功能具有相關(guān)性。通過(guò)臨床的前期研究我們發(fā)現(xiàn)益氣活血解毒方可以調(diào)節(jié)外周血中Tregs的水平，增強(qiáng)晚期卵巢癌患者機(jī)體的免疫力，從而降低其免疫抑制的作用，緩解患者的臨床癥狀，同時(shí)有效提高其生活質(zhì)量。初步實(shí)驗(yàn)研究也

7、發(fā)現(xiàn)益氣活血解毒中藥聯(lián)合DC疫苗對(duì)小鼠移植瘤生長(zhǎng)有抑制作用，其療效的發(fā)揮與免疫抑制因子TGFβ1和IL-10有關(guān)，而這兩種細(xì)胞因子來(lái)源于Tregs。故而我們推測(cè)該方延長(zhǎng)氣虛血瘀型晚期卵巢癌生存可能與調(diào)控Tregs相關(guān)的免疫有關(guān)。擬從Tregs切入，采用SNPs及mRNA芯片技術(shù)，用以探究與辨證論治療效有關(guān)的Tregs相關(guān)基因的多態(tài)(SNPs)特點(diǎn)及該方對(duì)對(duì)應(yīng)標(biāo)志基因表達(dá)的影響，方證與療效相結(jié)合，從而探索晚期卵巢癌氣虛血瘀證型的基因多態(tài)性

8、的特點(diǎn)以及其中藥干預(yù)機(jī)制，為中藥個(gè)體化治療提供實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。
　　目的:
　　1.篩選出與益氣活血解毒方療效相關(guān)的SNPs位點(diǎn);
　　2.探究益氣活血解毒方對(duì)差異SNPs對(duì)應(yīng)的基因mRNA表達(dá)的影響。
　　方法:
　　本研究共入組300例晚期卵巢癌患者，證候辨證為氣虛血瘀型。服益氣活血解毒方半年后抽取外周血10～15ml，運(yùn)用Illumina HumanExome-12v1-1芯片，從300例氣虛血瘀型晚期

9、卵巢癌患者的血液中提取DNA(TIANGEN TIANampBlood DNA Kit)，對(duì)樣品的gDNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)后進(jìn)行全基因組的擴(kuò)增、雜交，雜交后，通過(guò)清洗去掉非特異性結(jié)合的DNA，剩下特異性結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行單堿基延伸，染色后利用Illumina iScan Reader進(jìn)行掃描，將iScan系統(tǒng)掃描得到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Illumina官方軟件GenomeStudio Genotyping模塊中，利用該模塊進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。運(yùn)用Ge

10、neChip(R)PrimeView TM Human Gene Expression Array芯片，從氣虛血瘀型晚期卵巢癌患者的血液中提取mRNA。觀察患者的無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)，并對(duì)其進(jìn)行癌抗原125(CA125)數(shù)值的記錄及生活質(zhì)量的療后評(píng)估，根據(jù)患者的中位無(wú)進(jìn)展生存期將患者分為2組，一組為中藥有效組，其PFS＞中位無(wú)進(jìn)展生存，另一組為中藥無(wú)效組，其PFS≤中位無(wú)進(jìn)展生存。通過(guò)有效組和無(wú)效組SNPs比較，篩出顯著差異的SNPs

11、位點(diǎn)，即可能對(duì)中藥敏感的SNPs位點(diǎn)，GO分析:將顯著差異的SNPs位點(diǎn)定位得到基因利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)做功能富集，得到顯著的GO功能類(lèi)別，Pathway分析:得到的基因利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)做功能富集，得到差異基因顯著富集的生物通路;有效組和無(wú)效組mRNA表達(dá)的比較，篩選出差異表達(dá)的基因，同上，進(jìn)行GO分析和Pathway分析，得到差異顯著的GO功能類(lèi)別跟生物通路;將SNPs位點(diǎn)定位所得的基因與差異表達(dá)基因取交集，發(fā)現(xiàn)中藥干預(yù)的標(biāo)志基因。

12、>　　結(jié)果:
　　1.篩選出具有顯著性差異的SNPs位點(diǎn)1773個(gè)，位于外顯子上的SNPs位點(diǎn)共有1033個(gè)，非同義突變的SNPs位點(diǎn)有970個(gè);對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)與免疫相關(guān)的GO號(hào)有:GO:0006955、GO:0045087，其中GO:0006955與機(jī)體的免疫應(yīng)答有關(guān)，GO:0045087與先天性的免疫反應(yīng)有關(guān)，富集到GO:0006955上的基因有18個(gè)，具體為:FYB，RGS1，SUSD2，F(xiàn)CGRT,I

13、L18RAP, CR2,IFI44L, CD96, C8A, CD1C, CXCR5, IL16, SEMA4D, PDCD1LG2,HLA-DMA，MICA，PKHD1L1，HLA-DPA1;富集到GO:0045087上的基因有24個(gè)，具體是TAB2，F(xiàn)CN1，MAP3K1，GAB1，DTX4，VNN1，CR2，F(xiàn)OXO3，WIPF3，ITPR2, F12, TRAF3, CD180, EGF, NLRC5, C8A, NLRP4,

14、IFI16, TLR3, FRS2,CD14，CD19，BPIFB3，DEFB132。對(duì)變異位點(diǎn)基因KEGG富集分析得到有顯著差異的通路14條，主要涉及嗅覺(jué)傳導(dǎo)，酪氨酸代謝，糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨生物合成，脂肪酸的降解，精氨酸和脯氨酸代謝，β-丙氨酸代謝，莨菪烷類(lèi)、哌啶、毗啶生物堿生物合成，丙酮酸代謝，長(zhǎng)期的壓抑，黃酮和黃酮醇的生物合成，苯丙氨酸代謝，PPAR信號(hào)通路，堿基切除修復(fù)，味覺(jué)傳導(dǎo)等信號(hào)通路。
　　2.通過(guò)對(duì)mRNA

15、差異表達(dá)分析，得到顯著差異基因158個(gè)，其中上調(diào)基因58個(gè)，下調(diào)基因100個(gè)，通過(guò)上調(diào)的差異基因的GO分析發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)功能領(lǐng)域與免疫相關(guān)的GO號(hào)6個(gè)，GO:0002227、GO:0006955、GO:0002842、GO:0002768、 GO:0050776、 GO:0050777，GO:0002227，它們與粘膜上的先天免疫應(yīng)答、免疫應(yīng)答、正向調(diào)控T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的生物學(xué)功能

16、有關(guān);通過(guò)下調(diào)的差異基因的GO分析發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)功能領(lǐng)域與免疫相關(guān)的GO號(hào)有10個(gè)，GO:0002566，GO:0002684，GO:0002741,GO:0002925, GO:0002309, GO:0002827, GO:0002218, GO:0045087,GO:0045824，GO:0002286，它們與體細(xì)胞突變導(dǎo)致的免疫受體多元化、免疫系統(tǒng)的正向調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)中細(xì)胞因子的分泌調(diào)節(jié)、循環(huán)免疫球蛋白介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)、免疫應(yīng)答

17、、輔助T細(xì)胞Ⅰ型的免疫反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)的激活、先天免疫應(yīng)答、先天免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)中T細(xì)胞的激活有關(guān)。mRNA差異基因上調(diào)Passway富集得到8條相關(guān)的通路，主要涉及哮喘，瘧疾，造血細(xì)胞系，TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，吞噬體，異體移植排斥，腫瘤的轉(zhuǎn)錄失調(diào);下調(diào)的相關(guān)通路3條，主要涉及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，溶酶體，吞噬小體。
　　3.根據(jù)基因和表達(dá)譜的GO分析在免疫相關(guān)功能上取交集可知:與益氣活血解毒方療

18、效相關(guān)的可能的免疫方面的生物功能是免疫系統(tǒng)的應(yīng)答，具體的GO號(hào)是GO:0006955，基因分型富集到該term上的基因有18個(gè)，具體為:FYB，RGS1，SUSD2, FCGRT, IL18RAP, CR2, IFI44L, CD96, C8A, CD1C, CXCR5, IL16,SEMA4D，PDCD1LG2，HLA-DMA，MICA，PKHD1L1，HLA-DPA1，表達(dá)譜富集到該term上的基因有CEACAM8，DEFA1，DE

19、FA1，THBS1，CD24。
　　4.可能的中藥干預(yù)療效差異的標(biāo)志基因:CD40、AFF3、EIF2AK3、WNK1、FYB、FBXL13、 PLXNC1、BCL11A、IFI16、GNG7。
　　5.益氣活血解毒方能夠改善氣虛血瘀型晚期卵巢癌患者的免疫功能，產(chǎn)生差異療效。
　　6.益氣活血解毒方可以通過(guò)對(duì)基因以及相關(guān)通路的調(diào)節(jié)調(diào)控Tregs細(xì)胞，但與SNPs未見(jiàn)明顯相關(guān)性，可能與DNA去甲基化或miRNA有關(guān)。

20、r>　　結(jié)論:
　　1.與益氣活血解毒方療效相關(guān)的SNPs位點(diǎn)有1773個(gè)，這些位點(diǎn)可能是對(duì)中藥敏感的SNPs位點(diǎn)。
　　2.益氣活血解毒方療效的差異標(biāo)志基因可能為:CD40、AFF3、EIF2AK3、WNK1、FYB、FBXL13、PLXNC1、BCL11A、IFI16、GNG7。
　　3.益氣活血解毒方可能通過(guò)改善氣虛血瘀型晚期卵巢癌患者的免疫功能，產(chǎn)生差異療效。
　　4.益氣活血解毒方可能通過(guò)對(duì)基因以及相關(guān)