小鼠ICSI新技術(shù)及其用于提高人類輔助生殖技術(shù)的研究.pdf

1、胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)是20世紀80年代發(fā)展的一種新型輔助生殖技術(shù),其實質(zhì)就是用注射針攜帶單個精子直接注入到卵子胞漿內(nèi)從而帶到受精的目的。ICSI的建立為許多不孕不育夫婦帶來了福音,目前已成為治療男性不育的一種常規(guī)治療手段。然而由于缺少合適的動物模型,阻礙了人類ICSI研究。小鼠卵子是一個非常理想化的ICSI動物模型,但因小鼠卵子體積較小、抗損傷能力弱等原因,小鼠I

2、CSI研究進展緩慢。直到1995年Kimura等人將Piezo儀器用于小鼠卵ICSI,才獲得了較高的鼠卵成活率、受精率及囊胚率。然而,由于Piezo-ICSI效果不穩(wěn)定且存在潛在的汞污染而限制了其在臨床及科研上的應用。
　　 本文是對一項新研發(fā)的ICSI技術(shù)(New-ICSI,N-ICSI)的應用和改進。N—ICSI的方法為:將固定針做成喇叭狀的開口,先用固定針吸入部分透明帶及胞質(zhì),然后直接用常規(guī)的尖口注射針插入卵胞質(zhì)中,進行抽

3、吸破膜并注射精子。現(xiàn)對實驗結(jié)果歸納如下:
　　 ①比較卵子行N-ICSI和C-ICSI的體外發(fā)育情況。實驗表明,與常規(guī)的鼠卵注射方法(C-ICSI)相比,N-ICSI可以極其顯著提高鼠卵ICSI后成活率(22％vs89％,P<0.01)。鼠卵行N-ICSI的正常受精率、卵裂率及桑椹胚率分別為85％、71％和61％,與C-ICSI差異不顯著(88％、84％、76％,P>0.05)。N-ICSI和C-ICSI的囊胚率差異也不顯著(6

4、5％vs62％,P>0.05),但都顯著低于激活組(97％,P<0.05)。優(yōu)化和改善N-ICSI的實驗條件,也許可以提高成囊率。
　　 ②比較固定針開口內(nèi)徑及固定針吸入胞質(zhì)長度這兩個主要參數(shù)的不同組合對囊胚率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當固定針為45μm的時候,卵子的成活率較低(64％)顯著低于固定為50μm或55μm的卵成活率。而當吸入胞質(zhì)長度為75μm時,成囊率(0％和33％)顯著低于大部分其他組合,或者正常受精率極低(只有36％,其

5、余為三倍體或多倍體)。而當固定針內(nèi)徑為55μm,胞質(zhì)吸入長度為40μm時,卵子成活率、正常受精率、囊胚率。與內(nèi)徑為45μm吸長40μm相當,但內(nèi)徑為55μm的卵裂率明顯低于內(nèi)徑為50μm的卵裂率。而當固定針內(nèi)徑為50μm,胞質(zhì)吸入長度為40μm,可得到可觀的成活率,正常受精率,卵裂率,桑椹胚率和囊胚率,故將該組參數(shù)視為最佳N-ICSI條件。
　　 ③建立大批量小鼠卵子冷凍技術(shù),每個載體可以裝載20-50個卵子。將人精子注射(N-

6、ICSI)到這些解凍復蘇的小鼠卵子中并結(jié)合臨床ICSI資料,可以判定部分臨床ICSI過程失敗的原因。
　　 ④將N—ICSI最佳條件用于人精子注射鼠卵的跨物種ICSI,比較不同的人精子制動時間對鼠卵激活能力的影響。實驗表明:用人精子對鼠卵行N-ICSI,可得到80％以上的成活率、90％以上的受精率和70％的卵裂率；并發(fā)現(xiàn)人精子在制動30min內(nèi)激活鼠卵的能力沒有發(fā)生變化。
　　 以上結(jié)果表明,本研究建立了一種高效、便捷、