家蠅對鎘、鋅脅迫的響應(yīng)及其對土壤鎘、鋅污染的規(guī)避.pdf

1、目的：（1）了解家蠅幼蟲對Cd、Zn脅迫的響應(yīng)。（2）了解家蠅代謝殘?jiān)鼘d、Zn污染土壤的影響。
　　方法：1 Cd、Zn脅迫家蠅幼蟲實(shí)驗(yàn)：分別以0（對照）、1、20、70、250 mg/kg含鎘人工飼料、500、1000、5000、10000 mg/kg含鋅人工飼料喂飼一日齡家蠅幼蟲48 h，每組（含300 g干麥麩）喂飼900頭1日齡家蠅幼蟲，建立Cd、Zn脅迫家蠅一日齡幼蟲48小時(shí)動(dòng)物模型。測定家蠅三日齡幼蟲體重、體長，觀

2、察蛹的羽化率及成蟲壽命；提取家蠅三日齡幼蟲血淋巴，原子吸收分光光度計(jì)測定血淋巴鎘、鋅含量，蒽酮測定比色法血淋巴的總糖含量、考馬斯亮藍(lán)法測定血淋巴的蛋白質(zhì)含量、磷酸香草醛顯色反應(yīng)法測定血淋巴的脂肪含量，氨基酸分析儀測定游離氨基酸含量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測定三日齡幼蟲抗逆相關(guān)基因ATP合酶、精氨酸激酶、金屬硫蛋白、ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、MAF-1、超氧化物歧化酶、鐵蛋白的mRNA水平。2 Cd、Zn污染環(huán)境下家蠅規(guī)避重金屬危害的實(shí)驗(yàn)：（1）

3、盆栽菠菜試驗(yàn)共設(shè)（空白+5％同步發(fā)酵底料）、（空白+5%家蠅代謝殘?jiān)?0mg/kg Cd、（50mg/kg Cd+5%家蠅代謝殘?jiān)?00mg/kg Cd、（100mg/kg Cd+5%家蠅代謝殘?jiān)?00mg/kg Zn、（500mg/kg Zn+5%家蠅代謝殘?jiān)?000 mg/kg Zn、（1000mg/kg Zn+5%家蠅代謝殘?jiān)?0個(gè)處理組。菠菜收獲后，測定菠菜的生物量，ICP-OES測定土壤有效鎘、有效鋅及菠菜鎘

4、、鋅含量的影響，磷脂脂肪酸（PLFA）法測定土壤微生物多樣性，Elisa法測定土壤磷酸酶、轉(zhuǎn)化酶、纖維素酶、脫氫酶、脲酶。（2）家蠅代謝殘?jiān)屑讱に氐奶崛〖拌b定8%NaOH脫蛋白（80℃，3h）→1％KMnO4、1%草酸脫色（數(shù)小時(shí)）→2mol/L鹽酸脫無機(jī)鹽等雜質(zhì)的方法提取家蠅代謝殘?jiān)屑讱に?，KBr壓片紅外光譜法驗(yàn)證提取物。（3）抑菌實(shí)驗(yàn)采用多孔板-微量液體法測定家蠅幼蟲分泌物粗提液（幼蟲活體浸泡法獲得，蛋白含量169.1ug/ml

5、）和不同濃度蛆皮殼聚糖（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/ml）對重金屬有效性相關(guān)四株菌短小芽孢桿菌、黃色短桿菌、巨大芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌的抑制效果。
　　結(jié)果：1家蠅幼蟲在Cd、Zn脅迫下的指標(biāo)結(jié)果（1）生長發(fā)育、繁殖和壽命與對照組比較：70、250mg/kgCd脅迫組和1000、5000、10000mg/kg Zn脅迫組體重明顯降低；250mg/kgCd脅迫組和5000、10000mg/kg Zn脅迫

6、組體長明顯降低；1、20、70、250 mg/kg鎘暴露組家蠅蛹羽化率明顯降低；500、1000、5000、10000mg/kgZn脅迫組和1、20、70、250 mg/kg鎘暴露組家蠅成蟲壽命明顯縮短，250 mg/kg鎘暴露組家蠅成蟲壽命明顯短于其余各染鎘組。Cd、Zn與家蠅三日齡幼蟲體長、體重、蛹的羽化率均呈負(fù)相關(guān)；Cd與家蠅成蟲壽命呈負(fù)相關(guān)。（2）血淋巴Cd、Zn含量20、70、250mg/kgCd脅迫組家蠅幼蟲血淋巴Cd含量明

7、顯升高，Cd250組>Cd70組>Cd20組>Cd1組；Zn脅迫各組家蠅幼蟲血淋巴Zn含量明顯升高，Zn10000組>Zn5000組>Zn1000組>Zn500組。（3）血淋巴能量物質(zhì)含量1、20、70 mg/kgCd脅迫組和500、1000mg/kg Zn脅迫組三日齡幼蟲血淋巴總糖明顯降低；1、70、250 mg/kg Cd脅迫組和Zn脅迫各組三日齡幼蟲血淋巴脂肪的含量明顯降低；除20mg/kgCd脅迫組以外，各脅迫組血淋巴蛋白含量明

8、顯降低；Cd、Zn脅迫各組三日齡幼蟲血淋巴熱量值明顯下降。Cd、Zn與家蠅三日齡幼蟲血淋巴蛋白、脂肪、熱量值均呈負(fù)相關(guān)；Zn與家蠅三日齡幼蟲血淋巴總糖呈負(fù)相關(guān)。（4）血淋游離巴氨基酸含量1、20mg/kg Cd脅迫組家蠅3日齡幼蟲血淋巴生糖氨基酸濃度明顯降低，1、70、250mg/kg Cd脅迫組家蠅3日齡幼蟲血淋巴生酮氨基酸濃度明顯升高，1、20mg/kg Cd脅迫組家蠅3日齡幼蟲血淋巴生糖兼生酮氨基酸濃度分別明顯升高、降低；1000

9、 Zn脅迫組家蠅3日齡幼蟲血淋巴生糖氨基酸濃度明顯降低，5000、10000mg/kg Zn脅迫組家蠅3日齡幼蟲血淋巴生糖、生酮、生糖兼生酮氨基酸濃度及游離氨基酸總量均明顯降低。Cd與家蠅3日齡幼蟲血淋巴游離氨基酸總量、生糖氨基酸、Gly、Pro呈均正相關(guān)，Zn與家蠅3日齡幼蟲血淋巴游離氨基酸總量、生糖氨基酸、生酮氨基酸、生糖兼生酮氨基酸、Thr、Ser、Ala、 Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Arg均呈負(fù)相關(guān)

10、，與Glu呈正相關(guān)。（5）抗逆相關(guān)基因mRNA水平 Zn、Cd脅迫各組ATP合酶、金屬硫蛋白mRNA表達(dá)量均分別明顯升高；5000mg/kg Zn脅迫組和20mg/kg Cd脅迫組精氨酸激酶、MAF-1的mRNA表達(dá)量分別明顯升高；500、1000、10000mg/kg Zn脅迫組和1、20、250mg/kg Cd脅迫組ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA表達(dá)量明顯升高；500mg/kg Zn脅迫組鐵蛋白mRNA表達(dá)量明顯升高；500、1000、50

11、00mg/kg Zn脅迫組和Cd脅迫各組超氧化物歧化酶均明顯升高。此外，主成分分析結(jié)果表明，家蠅響應(yīng)Cd脅迫起主要作用的指標(biāo)貢獻(xiàn)從大到小依次為Cys、Met、Phe、Ser、Pro、Asp、Tyr、Arg、Thr、Leu、Lys、Ala、Val、His、血淋巴鎘濃度、Glu、Ile；響應(yīng)Zn脅迫起主要作用的指標(biāo)貢獻(xiàn)從大到小依次為Ser、Tyr、Ile、Met、Cys、Leu、Phe、Ala、Val、血淋巴鋅濃度、Glu、Gly、Arg、

12、Thr、His、Pro、Asp。2 Cd、Zn污染環(huán)境下家蠅規(guī)避重金屬危害的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果①土壤Cd、Zn有效性 Cd或Zn劑量相同時(shí)、加家蠅代謝殘?jiān)M土壤有效Cd或Zn含量均明顯低于未加家蠅代謝殘?jiān)M。②菠菜干重及Cd、Zn含量 Cd劑量相同、加家蠅代謝殘?jiān)c否的兩組間比較，加家蠅代謝殘?jiān)M菠菜地下部分鎘含量較未加家蠅代謝殘?jiān)M明顯降低；50mg/kg Cd組菠菜地上部分鎘含量較（空白+同步發(fā)酵底料）和（空白+家蠅代謝殘?jiān)?/p>

13、)組明顯升高，但(50mg/kgCd+家蠅代謝殘?jiān)?組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Zn劑量相同、加家蠅代謝殘?jiān)c否的兩組間比較，(500mg/kgZn+家蠅代謝殘?jiān)?組菠菜地上部分Zn含量較500mg/kgZn組明顯降低；加家蠅代謝殘?jiān)M菠菜地下部分Zn含量較未加家蠅代謝殘?jiān)M明顯降低有統(tǒng)計(jì)意義；加家蠅代謝殘?jiān)M菠菜地上部分干重較未加家蠅代謝殘?jiān)M明顯升高；與（空白+5%同步發(fā)酵底料）組比較，1000mg/kg單純加Zn組菠菜地上部分干重明顯降低，但

14、(1000mg/kg Zn+家蠅代謝殘?jiān)?組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③土壤生物活性 I土壤微生物種群結(jié)構(gòu)(a)多樣性指數(shù)結(jié)果：與（空白+同步發(fā)酵底料）比較，100mg/kg Cd污染組Shannon、Brillouin降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但（100mg/kg Cd+家蠅代謝殘?jiān)┙M差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；50mg/kg Cd組McIntosh指數(shù)降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01），但（50mg/kg Cd+家蠅幼蟲代謝殘?jiān)┪?/p>

15、染組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(b)不同微生物類群的代表性特征脂肪酸結(jié)果:加家蠅代謝殘?jiān)M10Me16:0相對生物量較單純鎘污染各組明顯升高；（50mg/kg Cd+家蠅代謝殘?jiān)┲舅?6:1ω5c相對生物量較50mg/kg Cd污染組明顯升高；與（空白+同步發(fā)酵底料）比較，100mg/kg單純Cd污染組16:1ω5c相對生物量明顯降低，但（100mg/kgCd+家蠅代謝殘?jiān)┙M差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與（空白+家蠅代謝殘?jiān)┍容^，50 mg/kg

16、單純Cd污染組16:1ω5c相對生物量明顯降低，但（50mg/kgCd+家蠅代謝殘?jiān)┙M差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。II土壤酶活性與（空白+同步發(fā)酵麥麩）組比較，100mg/kg單純Cd組磷酸酶明顯降低，但（100mg/kg Cd+家蠅代謝殘?jiān)┙M差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與（空白+5%家蠅代謝殘?jiān)┙M比較，500mg/kg Zn組磷酸酶明顯降低，但（500mg/kg Zn+家蠅代謝殘?jiān)┙M差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；1000mg/kg Zn組纖維素酶、脲酶明顯降

17、低，但（1000mg/kg Zn+家蠅代謝殘?jiān)┙M差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）甲殼素提取及鑒定結(jié)果紅外光譜圖證實(shí)從養(yǎng)蠅殘?jiān)刑崛〉郊讱に鼗驓ぞ厶?；?）抑菌試驗(yàn)結(jié)果蠅蛆殼聚糖對黃色短桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌的IC50分別為0.198、0.149、0.183、0.209mg/mL；蛋白含量為169.1ug/ml的家蠅分泌物粗提液對黃色短桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌的抑制率（%）分別為：5.49、4.84