叢枝菌根真菌14--3--3蛋白在共生信號傳導以及非生物脅迫反應的作用研究.pdf

1、叢枝菌根(AM)真菌是一種土傳真菌，屬于古老的球囊菌門，是叢枝菌根的重要共生體，增強植物養(yǎng)分的獲取和對各種非生物逆境的抗性的重要來源。與其顯著的生理意義相反，所涉及的分子基礎尚不清楚，主要是由于它們的專性生物營養(yǎng)和復雜的遺傳學。
　　14-3-3蛋白是一種高度保守的蛋白質家族，它廣泛存在于真核細胞中，14-3-3的同源或異源二聚體可以通過與其它蛋白質相互作用參與真核生物的信號傳導和代謝活性。
　　本實驗以摩西球囊霉（Funn

2、eliformis mosseae）的Fm201EST Tag為起點，分別從摩西球囊霉（Funneliformis mosseae）和根內球囊霉（Rhizophagus irregularis）中分離和鑒定了三個編碼叢枝菌根真菌14-3-3like蛋白的編碼基因，并分別命名為Fm201，Ri14-3-3和RiBMH2。通過熒光定量分析，發(fā)現Fm201，Ri14-3-3和RiRMH2的表達量在前共生（孢子萌發(fā)）和共生階段（附著胞形成，根內

3、菌絲形成，叢枝形成時期）中都出現了明顯的激增。因為缺乏有效的叢枝菌根真菌轉化系統(tǒng)，為了Fm201，Ri14-3-3和RiBMH2基因編碼的功能，引入了酵母異源驗證系統(tǒng)。釀酒酵母的14-3-3的雙突變（bmh1，bmh2）是致死的，本實驗通過在突變酵母BMH2時引入一個半乳糖誘導的Ga17啟動子啟動的叢枝菌根真菌14-3-3基因。數據表明，所有三個14-3-3like基因編碼蛋白在半乳糖培養(yǎng)基中均可以恢復釀酒酵母bmh1，bmh2致死雙突

4、變的正常代謝表型。
　　此外，本實驗在對Fm201基因進行3'RACE和5'RACE時，分別在它的5'UTR和3'UTR中各發(fā)現了一個內含子（或稱為選擇性剪接外顯子）。5'UTR的內含子被認為參與了基因轉錄的增強，而3'UTR內含子的出現時由加尾信號的選擇性識別引起的，這些被認為是高真核生物的基因調控機制。在對菌根共生過程中的Fm201L(含有長的3'UTR)和Fm201S（含有短的3'UTR））進行熒光定量分析是，且長短不同的F

5、m201在共生的不同時期出現了不同比例的波動。為了揭示這兩種選擇性剪切的內含子在14-3-3轉錄和翻譯過程中的作用。分別以YGPF為報告基因，以酵母BY4741為宿主分別檢測了5'UTR的轉錄活性和3'UTR在轉錄和翻譯水平上的穩(wěn)定性。結果表明，Fm201的UTRs可能對穩(wěn)定RNA或增強轉錄具有重要意義。
　　在對這三個14-3-3蛋白進行啟動子分析(ATG上游1.5Kb序列)時，在酵母啟動子相似的位置上發(fā)現了多個與非生物脅迫相關

6、的STRE(CCCCT/AGGGG)順式作用元件。重要的是，酵母單雜交分析表明，叢枝菌根真菌轉錄因子RiMsn2（酵母中STRE順式作用元件識別因子Msn2的同源蛋白）能夠識別存在于Fm201基因啟動子區(qū)的STRE元件。不僅如此，在酵母中當對Fm201的STRE元件進行點突變時，報告基因在非生物脅迫反映下的表達量出現了明顯的下降。
　　為了探索14-3-3蛋白在菌根共生關系維持過程中的作用，引入了宿主介導的基因沉默(Host In

7、duced Gene Silence)。當對根內球囊霉-蒺藜苜蓿共生體中的叢枝菌根真菌Ri14-3-3和RiBMH2基因進行沉默時時，共生體中的叢枝出現了早衰（或稱為提前降解）的現象。不僅如此，苜蓿一側與菌根叢枝形成相關的MtPT4和MtMST2基因的表達也出現了明顯的下調。這些現象均說明了叢枝菌根真菌14-3-3蛋白在共生關系的維持過程具有十分重要的意義。
　　進一步將叢枝菌根真菌和苜蓿蒺藜的菌根共生系統(tǒng)進行干旱或鹽分脅迫等非生