復合BMP-2來源新型短肽納米骨材料在骨修復中的應用研究.pdf

1、研究背景：
　　世界范圍內(nèi)，由創(chuàng)傷、腫瘤和感染等原因引起的骨缺損正逐年增加，對人們的健康產(chǎn)生越來越大的影響。在我國，由于骨缺損而需要接受治療的患者每年大約有400萬。除了疾病引起的骨缺損需要骨移植外，整形美容外科手術(shù)中也經(jīng)常需要骨移植來塑形[1]。骨移植材料已成為僅次于輸血的需求量最大的移植物，而且有逐年增多的趨勢。迄今為止，自體骨移植作為金標準廣泛應用于臨床，但是其存在來源有限和供區(qū)功能缺失的問題，并且取骨的過程會造成患者持續(xù)疼

2、痛、神經(jīng)損傷和新的骨折等，限制其臨床應用;同種異體骨因存在免疫反應和傳播疾病的危險，也限制其在臨床的應用。因此，研制理想的骨移植物修復骨缺損成為醫(yī)學和生物材料科學領(lǐng)域中的重要課題。
　　理想的骨移植材料應該具有良好的生物相容性、可降解性、骨傳導性和骨誘導性[2]。在過去的10年間，研究的熱點集中在骨移植材料的設計和體內(nèi)外應用上，已有許多研究者研發(fā)了多種骨修復材料。天然骨主要由磷灰石和膠原組成。因此，由羥基磷灰石和膠原組成的骨修復材

3、料研究廣泛。通過自組裝的方法，清華大學的崔福齋教授課題組研制出一種新型的納米羥基磷灰石/膠原(nHAC)材料。通過實驗表明，該材料無論是在結(jié)構(gòu)上，還是在成分上，可以媲美天然骨組織。Nature Materials曾發(fā)表評論:崔教授課題組的工作是具有開創(chuàng)性的工作。他們找到了用仿生自組裝制造生物材料的新方法。同時，骨礦化膠原的分級結(jié)構(gòu)理論在實驗中得到證實。聚乳酸(PLLA)具有無毒性和可降解性，被廣泛應用于骨組織工程支架材料的研究，并被美國

4、食品與藥品管理局(FDA)批準廣泛用作手術(shù)縫合線、體內(nèi)支架，并可以作為藥物控釋載體[1]。由nHAC和PLLA構(gòu)成的新型骨組織工程材料nHAC/PLLA已成功制備。其構(gòu)成和分級的微觀結(jié)構(gòu)都類似天然骨組織，可以提高細胞的粘附力、刺激細胞增殖和分布。自2011年被食品和藥品監(jiān)督局批準注冊證以來，臨床已應用上萬例，臨床數(shù)據(jù)顯示其具有廣闊的臨床應用價值。
　　骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMPs）

5、最早由Urist發(fā)現(xiàn)并命名。BMPs是一組具有類似結(jié)構(gòu)的高度保守的功能蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，BMPs有多種生物學功能。其最為研究者關(guān)注的功能為其能夠在體內(nèi)誘導骨和軟骨形成。無論是在肢體生長、軟骨內(nèi)骨化等生理狀態(tài)下，還是在骨折后修復、軟骨損傷后修復等病理狀態(tài)下，均可表達。在骨骼的胚胎發(fā)育以及骨折后的修復中均起到重要作用。BMP-2是目前研究最為廣泛、誘導成骨活性最強的BMPs之一。天然的BMP-

6、2雖然具有較強的誘導成骨的能力，但存在數(shù)量有限，價格較高等問題。臨床上通過載體負載應用BMP-2，在和載體負載后，帶來很多問題。例如，分子的活性在有些情況下會受到干擾。如大分子蛋白質(zhì)吸附在材料表面后會隨機折迭，使活性位點難以暴露，降低其生物活性;另外，難以持續(xù)，緩慢釋放。在生物環(huán)境中早期突釋，隨后濃度迅速下降，達到治療水平以下，作用時間短暫。經(jīng)過美國FDA認證的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP-2)在工藝，質(zhì)控，安全性方面還存在各種問

7、題，無法大規(guī)模的生產(chǎn)[3]。
　　清華大學材料科學與工程學院生物材料組組根據(jù)BMP2的活性核苷酸序列，用化學合成法合成含有17個氨基酸的新型短肽P17-BMP-2。該短肽克服了國內(nèi)外基因工程技術(shù)制備的rhBMP-2的缺點。其與BMP2的骨誘導活性相類似，同時應用了固相合成法，工藝更為簡單，可以用多肽合成儀大量制備。解決了rhBMP-2無法大規(guī)模生產(chǎn)以及安全性的難題。P17-BMP-2僅含有17個氨基酸，可以有效地克服大分子所帶來的

8、抗原性以及其他一些生物副作用。結(jié)構(gòu)簡單，生物性狀更加穩(wěn)定，活性更好。而且，非常方便對該肽鏈進行修飾?？梢哉f，該核苷酸序列繼承了BMP-2的活性，克服了其缺點。
　　因此，本課題將清華大學饋贈的新型短肽P17-BMP-2與高誘導性膠原基納米羥基磷灰石骨材料(nHAC/PLLA)復合，通過體外細胞實驗，研究新型短肽P17-BMP-2體外誘導成骨能力，及將其負載到nHAC/PLLA上后，通過動物實驗，研究該種新材料在促進骨缺損修復過程中

9、的作用及變化，為其臨床應用提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。
　　研究目的：
　　1.利用固相多肽合成法合成含有17個氨基酸的新型短肽P17-BMP-2.
　　2.研究P17-BMP-2的誘導成骨的能力
　　3.利用吸附法將短肽P17-BMP-2負載于膠原基納米羥基磷灰石復合材料中(nHAC/PLLA)。
　　4.檢測負載P17-BMP-2短肽的材料的體外控釋效果。
　　5.通過體外細胞實驗和兔體內(nèi)植入實驗驗證

10、負載P17-BMP-2短肽的材料的體內(nèi)外誘導成骨能力。
　　研究方法：
　　1.新型短肽P17-BMP-2的制備
　　首先通過固相多肽合成法(FMOC/tBU)合成粗肽。通過凝膠過濾層析初步純化粗肽，通過高效液相色譜法再次純化，最后由質(zhì)譜儀檢測確定短肽序列。
　　2.P17-BMP-2體外誘導活性實驗
　　取培養(yǎng)第2、3周細胞，根據(jù)堿性磷酸酶(AKP)測定試劑盒，檢測各組AKP的含量。
　　3.新型短

11、肽P17-BMP2與支架材料nHAC/PLLA的復合
　　掃描電鏡，透射電鏡下觀察支架材料nHAC/PLLA
　　無菌條件下，將P17-BMP-2溶于去離子水，調(diào)節(jié)到所需濃度(2 mg/ml和10mg/ml)。納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸材料(nHAC/PLLA)(5×5×5mm)分別浸漬到P17-BMP-2溶液，輕輕攪拌2小時200 rpm。真空干燥，烘干、冷凍、消毒。
　　4.將p17-bmp-2負載于nHAC/P

12、LLA，同種異體骨，可吸收膠原蛋白海綿，應用BCA蛋白濃度測定試劑盒，比較緩釋活性。
　　5.復合短肽nHAC/PLLA上培養(yǎng)細胞的活性檢測
　　將鼠MSC種植于各組材料上，分別于種植2、4、6天后，通過MTT法檢測各組材料上鼠MSC的增殖情況。細胞PI染色，激光共聚焦檢測細胞增殖情況。
　　6.動物實驗
　　所有實驗動物隨機分為四組，每組5只:A:空白對照不植入材料，B:nHAC/PLLA, C: nHAC/P

13、LLA/P17-BMP-2(2mg/g), D: nHAC/PLLA/P17-BMP-2(10mg/g)。在下頜體制備極限骨缺損(10mm×5mm×5mm)的非貫穿骨缺損，保留頰舌側(cè)骨皮質(zhì)。
　　7.影像學分析
　　取術(shù)后2，4周不同時期的動物標本，行X線檢查。根據(jù)Lane-Sandhu X線評分標準法，對骨愈合過程中的骨癡量、骨連接、骨塑形等情況進行綜合評分，客觀評估新骨形成的情況。
　　8.組織學分析
　　骨

14、材料分別在植入后2，4周處死動物，完整取下術(shù)區(qū)下頜骨，4℃固定于含有4％的多聚甲醛和0.2％苦味酸，pH=7.4的0.1M磷酸鹽緩沖液中7天，并在pH=7.5，20％ EDTA溶液中脫鈣8周，后流水沖洗12h以上。經(jīng)過脫水、透明，石蠟包埋后，連續(xù)切取5μm組織片10張，進行組織學染色(H.E.)。采用Lane and Sandhu開發(fā)的組織學評分系統(tǒng)進行統(tǒng)計學處理。
　　研究結(jié)果：
　　1.高壓液相色譜儀顯示合成肽的純度為9

15、6％，質(zhì)譜圖顯示合成肽的平均分子量為2023.67m/z，與理論上設計多肽的平均分子量一致，短肽序列正確，滿足實驗需求。
　　2.堿性磷酸酶結(jié)果顯示:隨時間延長，各組材料中堿性磷酸酶含量逐漸增高。在第2周和第3周時，含有10ug/ml新型短肽材料略低于陽性對照組。各實驗組堿性磷酸酶含量明顯高于陰性對照組。同一時間點，含有30ug/ml P17-BMP-2的材料組堿性磷酸酶含量明顯優(yōu)于其他組。
　　3.電鏡觀察nHAC/PLL

16、A，可見不規(guī)則排列的孔隙結(jié)構(gòu)
　　4.P17-BMP-2負載于nHAC/PLLA，緩釋效果優(yōu)于同種異體骨
　　5.MTT結(jié)果顯示各組材料隨著時間的推移細胞數(shù)量逐漸增加，活性增強。含有10mg/g短肽P17-BMP-2的材料組細胞活性最強。細胞染色后，激光共聚焦檢測顯示10mg/g短肽P17-BMP-2的材料組細胞活性最強。
　　6.影像學分析結(jié)果顯示:術(shù)后2周時，空白對照組未見有骨密度影形成，植入骨修復材料組均可見低密

17、度影形成，且復合新型短肽的材料組密度影比對空白對照組和單純材料組密度影要深。術(shù)后4周，各組密度影都比術(shù)后2周時加深，并且面積增大?？瞻讓φ战M密度影加深但是不連續(xù)。復合新型短肽含量高的密度影最深面積基本完全充滿缺損部位。根據(jù)Lane-Sandhu X射線評分標準計算結(jié)果顯示術(shù)后4周的分值明顯高于術(shù)后2周。且隨著復合新型短肽P17-BMP-2的含量的增多其分值越高。
　　7.組織學分析結(jié)果顯示:術(shù)后2周，A組（空白對照組）在缺損區(qū)邊緣

18、處有纖維結(jié)合，見成纖維細胞形成。B組（單純材料組）可見兔宿主骨組織與植入材料結(jié)合部位開始模糊，有纖維連接，大量結(jié)締組織形成。并且結(jié)締組織、成纖維細胞長入材料深部，但未長滿材料。材料與宿主骨交界處可見小血管形成，炎性細胞浸潤材料。材料有輕微降解。C組和D組（植入復合新型短肽P17-BMP-2的材料組），可見有大量炎性細胞浸潤，成纖維細胞、結(jié)締組織形成，纖維連接更明顯，有大量小血管生成和骨母細胞長入，隨著新型短肽含量增多可見有早期骨形成和活

19、躍的新骨化組織形成，可見材料有輕微降解。術(shù)后4周，A組（空白對照組），可見明顯纖維連接，有活躍的新骨形成。B組（植入nHAC/PLLA材料組）有少量炎性反應，結(jié)締組織，大量纖維連接在宿主骨與植入材料交界處形成，有大量小血管形成，并且有活躍的新骨形成，少量骨聚集?？梢姴牧厦黠@降解。C組和D組（植入復合新型短肽P17-BMP-2的材料組）可見炎性細胞浸潤比2周時明顯減少，有大量活躍的新骨形成，并且隨著新型短肽含量增多新骨形成增多，并且新骨聚

20、集形成新的骨化結(jié)構(gòu)。宿主骨與新形成的骨形成連接界限模糊，可見早期皮質(zhì)骨形成?？梢娭踩氩牧厦黠@降解。
　　根據(jù)Lane-Sandhu組織學評分標準計算分析結(jié)果顯示，術(shù)后4周骨缺損修復顯著優(yōu)于術(shù)后2周時的修復，組織學評分均值差異，有統(tǒng)計學意義(p＜0.001)。術(shù)后4周，D組骨缺損修復明顯優(yōu)于其他各組。
　　結(jié)論：
　　1.利用固相多肽合成法合成含有17個氨基酸的新型短肽P17-BMP-2，序列正確。
　　2.新型短