親骨性BMP-2活性多肽及其仿生骨修復材料生物活性的實驗研究.pdf

1、第一部分兩種不同BMP2活性多肽的親骨性評價
　　目的：對比研究兩種不同BMP-2活性多肽的親骨性,以探討影響多肽親骨性的相關因素。
　　方法：以固相合成法分別合成兩種不同的BMP-2活性多肽P20和P24,在P24中增加設計聚天冬氨酸短肽和磷酸化絲氨酸活性位點。以納米羥基磷灰石晶體模擬骨組織,采用經(jīng)典的吸附法對兩種多肽進行初步的體外骨吸附性能研究,分別在不同吸附時間和不同質量羥基磷灰石介質的條件下考察兩種多肽對羥基磷灰石的

2、吸附率。
　　結果：兩種BMP-2活性多肽在30min內均能與羥基磷灰石迅速吸附,此后隨時間延長吸附速度減緩,P20在60min時吸附率達到峰值,而P24在90min時達到峰值,為P20的兩倍。兩種多肽的吸附率隨著羥基磷灰石質量的增多而升高,在5mg、10mg和15mg三種不同羥基磷灰石量時P24的吸附率均顯著高于P20(P<0.05),P24對15mg羥基磷灰石的吸附率幾乎是同樣條件下P20的3倍。
　　結論：通過加入聚天

3、冬氨酸和磷酸化絲氨酸活性位點可顯著增強BMP-2活性多肽的親骨性,P24具有良好的親骨性。親骨性BMP-2活性多肽對羥基磷灰石的最佳吸附時間是90min,且其吸附率與羥基磷灰石質量呈正相關。
　　第二部分攜載不同BMP2活性多肽的仿生骨基質材料體外控釋及其對MC3T3-E1細胞粘附、增殖及成骨分化能力的影響
　　目的：觀察兩種BMP-2活性多肽的體外釋放動力學,評價不同多肽和仿生骨基質材料對小鼠MC3T3-E1前成骨細胞粘附

4、、增殖和成骨分化能力的影響。
　　方法：將兩種不同的BMP-2活性多肽P20和P24分別與TBC和nHAC/PLA兩種載體材料復合,構建P20/TBC、P20/nHAC/PLA、P24/TBC和P24/nHAC/PLA仿生骨基質材料,同時以P24/可吸收膠原蛋白海綿緩釋體為對照比較BMP-2活性多肽在各種支架材料中的釋放動力學。為評價各仿生骨基質材料的生物學活性,將實驗分為空白對照、P20和P24三組,每組另設TBC和nHAC/P

5、LA兩個亞組。分別將小鼠MC3T3-E1前成骨細胞種植在各組材料表面,分別測定細胞在材料表面的粘附率,采用MTT法檢測MC3T3-E1細胞在材料上的增殖活性,通過檢測堿性磷酸酶(ALP)活性來評價MC3T3-E1細胞在各組材料上的成骨分化活性。
　　結果：體外控釋實驗發(fā)現(xiàn)P24和P20無論在nHAC/PLA還是TBC材料中,均較P24在ACS材料中釋放更加緩慢,同時P24較P20在兩種材料中的緩釋效果更突出。而細胞粘附率、MTT實

6、驗及ALP活性檢測結果顯示,MC3T3-E1細胞在所有多肽組仿生骨基質材料表面的粘附和增殖能力及ALP活性均顯著高于空白組,而在P24組顯著高于P20組,在P24/TBC組顯著高于P24/nHAC/PLA組,組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結論：TBC和nHAC/PLA均適合作為BMP-2活性多肽的緩釋載體材料,且TBC尤為理想。親骨性可明顯增強P24在TBC和nHAC/PLA材料中的緩釋性能,并能明顯促進小鼠MC3

7、T3-E1前成骨細胞在材料上的粘附、增殖和成骨分化。
　　第三部分不同BMP2活性多肽/仿生骨基質材料復合物體內誘導異位成骨的實驗研究
　　目的：比較P20和P24與TBC和nHAC/PLA構建的仿生骨基質材料的異位成骨能力,探討親骨性對多肽骨誘導活性的影響。
　　方法：將30只SD大鼠隨機分為空白組、P20組及P24組,每組下設煅燒骨和nHAC/PLA兩個亞組。每只大鼠制備雙側股四頭肌肌袋模型,按實驗分組分別于左側放

8、入TBC材料,右側放入nHAC/PLA材料。植入材料后第2、8周分別做放射學檢測(X-ray、3D-CT)并記錄植入體CT骨密度值(HU)。術后2、8周分別處死大鼠取材,應用高分辨率MicroCT測定標本內羥基磷灰石總體積值(BV),然后標本行HE染色組織學檢測。
　　結果：8周時X線檢測可見P24組植入體密度均較2周時增高,P20及空白組密度變化不明顯。CT掃描骨密度檢測結果顯示,8W時P20/TBC組、P24/TBC組植入體骨

9、密度值較2W時明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而空白組、P20/nHAC/PLA組和P24/nHAC/PLA組植入體骨密度值較2W時僅略增高,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。BV定量結果顯示:在TBC組,2W和8W時P24組BV值均顯著高于其他各組,P20組僅8W時顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。nHAC/PLA組在2W時各組間無顯著性差異(P>0.05),8W時P24組BV值顯著高于其他各組,P20組顯

10、著高于空白組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。組織形態(tài)學觀察2周時P24/TBC組植入體孔隙內可看到散在的類骨質形成。8周時P24/TBC組可見大量編織骨形成、有較多活躍的成骨細胞及新生血管結構。P24/nHAC/PLA組新生骨組織明顯少于P24/TBC組。P20組僅見散在類骨質形成?？瞻捉M無明顯成骨。
　　結論：煅燒骨和nHAC/PLA均是理想的骨組織工程支架材料,增加親骨性后能顯著增強BMP-2活性多肽與兩種材料復合構建的仿

11、生骨基質材料的異位成骨能力
　　第四部分親骨性BMP2活性多肽/煅燒骨復合支架材料修復犬橈骨臨界性缺損的實驗研究
　　目的：觀察親骨性BMP-2活性多肽P24/煅燒骨復合材料修復犬橈骨臨界性骨缺損的能力,探討其進一步應用的可行性。
　　方法：6只比格犬制備雙側橈骨中段20mm臨界性骨缺損,按側別隨機分為4組,空白對照組骨缺損處不放置任何植入物,TBC組植入單純TBC材料,P24組植入P24/TBC復合材料,BMP2組植

12、入rhBMP2/TBC復合材料。術后12周和24周分別行X線檢測,術后24周取材行CT掃描加三維重建并行組織學檢測評價各組材料的骨修復能力。
　　結果：影像學及組織學檢測結果均提示空白對照組骨缺損處無新骨形成;TBC組各時間點影像學檢查均無明顯骨痂形成,骨-材料界面無明顯融合,組織學觀察可見缺損內少許類骨質和編織骨形成,無板層骨結構;P24組在12W時骨-材料界面模糊,有少許骨痂形成,24W時較多骨痂形成,骨-材料界面已融為一體。