重組制備人細(xì)胞質(zhì)谷草轉(zhuǎn)氨酶及結(jié)晶條件研究.pdf

1、碩士學(xué)位論文重組制備人細(xì)胞質(zhì)谷草轉(zhuǎn)氨酶及結(jié)晶條件研究StudiesonRecombinantPreparationandCrystallizationConditionofHumanCytoplasmicGlutamateOxaloacetateTransaminase(GOTl)學(xué)號：2131星Q80完成日期：至Q!魚生壘目墨Q日大連理工大學(xué)DalianUniversityofTechnology大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要谷草轉(zhuǎn)氨酶

2、(Glutamateoxaloacetatetransaminase，GOT)主要催化L天冬氨酸和a一酮戊二酸生成L谷氨酸與草酰乙酸的可逆反應(yīng)，在生物體內(nèi)的碳和氮的代謝中扮演著重要角色。谷草轉(zhuǎn)氨酶作為依賴磷酸吡哆醛(Pyridoxal5phosphatedependent，PLP)的酶類，在人體內(nèi)存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，分別稱之為GOTI和GOT2。GOTl被證明是維持胰腺癌細(xì)胞氧化還原平衡和癌細(xì)胞生長所需的谷氨酰胺碳骨架代謝中的關(guān)鍵物

3、質(zhì)，因此GOTl是抗腫瘤藥物的分子靶標(biāo)，解析GOTI的結(jié)構(gòu)將有助于設(shè)計，選擇抑制癌細(xì)胞生長的藥物。(1)GOTl的高純度重組表達(dá)與性質(zhì)分析通過構(gòu)建表達(dá)載體pET22bgotl，重組酶在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了可溶性表達(dá)。通過HisTrapTMFFcrudecolumn柱層析和HiTrapTMQXL陰離子交換柱層析分離純化得到了高純度蛋白。蛋白比活力為7083U／mg，純化倍數(shù)為1336倍，活力回收率為183％。凝膠排阻色譜表明

4、重組GOTl的聚集形式為二聚體，所形成的二聚體的分子量為66kDa。該酶的最適溫度為37。c，最適pH75。在3545oC，及堿性條件下(pH75～10。0)，酶的穩(wěn)定性較好。純化后的GOTI被Na、K和M92金屬離子輕微的抑制，被Zn2、Mn2、Cu2、Ni2、C02和Ca2金屬離子顯著抑制。(2)GOTl的結(jié)晶條件篩選及晶體數(shù)據(jù)解析初始篩選目的蛋白GOTl的晶體的蛋白濃度為5mg／ml，并確定了三個初篩的條件，分別是CrystalS

5、creen試劑盒的No9(02Mammoniumacetate，01MNacitratetribasicdihydratepH56，30％w／vPolyethyleneglycol4000)，Index試劑盒的No42(O1MBISTrispH55，20％w／vPEG3350)，Index試劑盒No43(01MBISTrispH65，25％w／vPEG3350)。經(jīng)過條件優(yōu)化，最終確定重組GOTl的結(jié)晶最佳條件為01MBIS—Trisp

6、H60，21％w／vPEG3350。GOTl的晶體(PDB登錄號：3WZF)通過氣相擴散懸滴法獲得，結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)利用X一射線衍射收集。解析后的晶體分辨率為299A，晶體屬于空間群P43212，晶胞參數(shù)為a=934A，b=934A，c=l074A，n亍薩7=900。(3)谷草轉(zhuǎn)氨酶的生物信息學(xué)分析雖然二種人來源的細(xì)胞質(zhì)谷草轉(zhuǎn)氨酶在表達(dá)載體及結(jié)晶條件上采用的方法不同，但二者整體序列的相似度上達(dá)95％。晶體3110的100％的殘基位于合理允許區(qū)域