棉花細胞質雄性不育機理的研究.pdf

1、植物細胞質雄性不育(cytoplasmic male steriltiy，CMS)是一種不能產生有活力花粉的遺傳現(xiàn)象，屬母性遺傳，在植物雜種優(yōu)勢利用中具有重要價值。棉花細胞質雄性不育機理的相關研究報道不是很多，同玉米、水稻等作物雄性不育機理研究相比，要遠遠落后。因此，開展棉花細胞質雄性不育的分子機理研究，便于更好的利用棉花雜種優(yōu)勢，具有重要的理論和實踐意義。哈克尼西棉(Gossypum harknessii Brandegee)細胞質雄

2、性不育是由細胞質基因控制的并可被核恢復基因抑制的性狀，其花藥在造孢細胞增殖期就開始退化，并在花粉母細胞減數(shù)分裂時期達敗育高峰，進而花粉母細胞不能形成四分體，是一種無花粉粒的雄性不育。這種雄性細胞退化早、敗育過程清晰和凋亡徹底的花藥，既是雜交棉制種的有利條件，也是雄性不育機理研究的良好材料。 為此，本文以哈克尼西棉雄性不育系和保持系花藥為材料，通過比較花藥線粒體超微結構、與CMS相關的線粒體基因序列及基因表達、線粒體代謝酶類的生化

3、分析、線粒體活性氧代謝變化及活性氧清除酶基因的表達，尋找與棉花細胞質雄性不育相關的基因，并探討細胞質雄性不育產生的可能的分子機理。研究主要結果如下： 1．通過對棉花不育系和保持系不同發(fā)育時期花藥的超微結構觀察，發(fā)現(xiàn)不育系花藥在造孢細胞增殖期，線粒體就已出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為輕微腫脹，出現(xiàn)電子透明區(qū)。在小孢子母細胞形成期普遍表現(xiàn)出線粒體體積膨脹、內嵴模糊、線粒體空泡化、基質淡化等異?，F(xiàn)象，進入減數(shù)分裂時期后，線粒體、液泡等細胞器逐漸解體

4、、消失。在不育系小孢子發(fā)育不同時期觀察到無嵴或嵴不發(fā)達乃至空泡化的線粒體，這些線粒體不能行使正常代謝功能，以致ATP產生受到限制，能量供應不足，最終導致花粉敗育。所以，線粒體的結構異常是棉花細胞質雄性不育系小孢子敗育的重要細胞學特征。 2．通過同源克隆方法，在棉花不育系和保持系線粒體基因組中克隆與CMS相關的線粒體基因，發(fā)現(xiàn)線粒體atp6、atp9、nad3、nad6、nad9、cob、coxⅠ和coxⅡ基因片段的核苷酸序列在不

5、育系和保持系中沒有差異，但是線粒體基因coxⅢ在不育系和保持系中存在堿基突變。不育系和保持系線粒體coxⅢ基因全部編碼序列大小沒有差異，都為798bp，但序列內部有5個堿基發(fā)生了突變，其中3個堿基突變造成編碼的氨基酸發(fā)生了變異。與保持系相比，不育系coxⅢ基因編碼區(qū)的A<'184>、C<'255>、A<'366>、C<'442>和G<'516>分別被替換為C、T、C、A和C。根據(jù)核苷酸序列推導棉花coxⅢ基因編碼265個氨基酸。不育系c

6、oxⅢ基因推導的氨基酸Ser<'62>、Lys<'122>、Thr<'148>分別被Mg、Asn和Asn替代，而Ser<'85>和Leu<'172>因存在密碼子簡并現(xiàn)象未發(fā)生變化，不育系在coxⅢ基因上既發(fā)生了錯義突變又發(fā)生了無義突變。經(jīng)同源性分析，發(fā)現(xiàn)棉花不育系coxⅢ基因的核苷酸序列，與擬南芥、油菜、煙草和玉米等coxⅢ基因的核苷酸序列相比，它們的序列同源性都高達95％。利用RT-PCR和熒光定量RT-PCR方法研究上述與CMS相關

7、的線粒體基因的表達時，發(fā)現(xiàn)在整個花藥發(fā)育過程中，與CMS相關的線粒體基因在不育系中的表達量總體上要低于保持系。在花藥敗育高峰期(花粉母細胞減數(shù)分裂期)，與CMS相關的線粒體基因在不育系花藥中的表達量要顯著低于保持系。 3．通過對不育系和保持系葉片、花藥細胞色素氧化酶的活性和同工酶活性測定，以及細胞色素氧化酶的細胞化學定位分析，發(fā)現(xiàn)不育系和保持系葉片細胞色素氧化酶的活性和同工酶活性沒有明顯差異，而在花藥組織中存在顯著差異。在花藥敗

8、育初期(造孢細胞增殖期)，不育系花藥中細胞色素氧化酶活性、同工酶活性和線粒體膜上嗜鋨顆粒的數(shù)量與對應的保持系沒有顯著差異。在花藥敗育高峰期，不育系花藥細胞色素氧化酶活性和同工酶活性要顯著低于保持系花藥，不育系花藥線粒體膜和嵴上嗜鋨顆粒的數(shù)量要明顯少于保持系花藥。在花藥敗育后期，不育系花藥細胞色素氧化酶的活性同保持系相比差異不顯著。棉花不育系細胞色素氧化酶活性的降低可能與小孢子的敗育和雄性不育的發(fā)生有重要聯(lián)系。 4．通過測定不育系

9、、保持系和雜種Fl葉片、花藥及其線粒體活性氧含量、活性氧清除酶的活性，以及抗氧化酶基因的表達分析，發(fā)現(xiàn)葉片活性氧的含量和活性氧清除酶的活性在不育系、保持系和雜種F<,1>中沒有顯著差異。在花藥敗育初期，不育系花藥中活性氧含量稍高于保持系，活性氧清除酶的活性和抗氧化酶基因的表達水平與保持系沒有明顯差異。但在花藥敗育高峰期，不育系花藥一方面活性氧含量極顯著高，另一方面活性氧清除酶活性和抗氧化酶基因的表達水平極顯著低，活性氧代謝平衡被打破，造

10、成過量活性氧的積累，產生氧應激，對細胞發(fā)育產生毒害。在花藥敗育過程中，雜種F<,1>不同于不育系，始終與保持系一樣保持正常的活性氧含量和穩(wěn)定的抗氧化酶轉錄表達水平。當恢復基因導入不育系后，雜種F<,1>花藥中過量產生的活性氧能得到清除，這可能是由于核恢復基因對棉花花藥活性氧產生與清除的動態(tài)平衡具有調控作用。 綜上所述，提出哈克尼西棉細胞質雄性不育的可能的機理，即線粒體呼吸鏈代謝coxⅢ基因的突變和線粒體結構異常，使線粒體電子傳遞

11、途徑不暢，造成花藥中ROS大量產生。由于可育花藥和葉片等其他組織具有較高的活性氧清除酶的活性，另外葉片等其他組織對活性氧的敏感程度不如花藥雄性細胞(花粉母細胞)，所以可育花藥和葉片等其他組織中活性氧水平能保持正常，可育花藥和葉片等其他組織能夠正常發(fā)育。而在不育花藥中，線粒體活性氧的大量產生，同時線粒體抗氧化酶的活性和基因表達水平顯著降低，細胞質中活性氧清除酶的活性在花藥敗育階段也很低，導致不育花藥細胞大量產生的活性氧不能得到及時、有效的