MicroRNA對(duì)鐵觀音茶樹(shù)干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制研究.pdf

1、干旱是在我國(guó)主要產(chǎn)茶區(qū)普遍發(fā)生的主要自然災(zāi)害，且茶樹(shù)是一種葉用植物，其生長(zhǎng)的健康與否直接影響茶葉的品質(zhì)。愈來(lái)愈多的研究表明microRNA(miRNA)在植物干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。為研究miRNA對(duì)鐵觀音茶樹(shù)干旱脅迫的相應(yīng)機(jī)制，本文采用補(bǔ)水稱(chēng)重法，對(duì)干旱脅迫的鐵觀音茶樹(shù)進(jìn)行sRNA分離鑒定，對(duì)鐵觀音茶樹(shù)不同程度干旱脅迫過(guò)程中的部分相關(guān)miRNA進(jìn)行定量表達(dá)分析。主要研究結(jié)果如下：
　　1、鐵觀音茶樹(shù)干旱脅迫過(guò)程中主要

2、生化成分變化
　　本研究采用補(bǔ)水稱(chēng)重法對(duì)盆栽鐵觀音茶苗進(jìn)行正常供水（對(duì)照CK）、輕度干旱脅迫（T1）、中度干旱脅迫（T2）、重度干旱脅迫（T3）四組處理，研究發(fā)現(xiàn)，隨著干旱脅迫程度的增強(qiáng)，葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量的下降，葉片光合速率減弱。干旱脅迫程度的加劇引發(fā)植物的膜質(zhì)損傷，使植物葉片中MDA的含量增加，電解液外滲，電導(dǎo)率增強(qiáng)。當(dāng)鐵觀音茶樹(shù)遭受輕度干旱脅迫和中度干旱脅迫時(shí)，鐵觀音茶樹(shù)葉片MDA含量略有增加，植物細(xì)胞電導(dǎo)率略

3、微增強(qiáng)。當(dāng)鐵觀音茶樹(shù)遭受重度脅迫時(shí)，葉片中MDA含量及葉片電導(dǎo)率增加趨勢(shì)明顯。
　　2、Solexa測(cè)序技術(shù)鑒定鐵觀音茶樹(shù)干旱脅迫過(guò)程中的sRNA
　　通過(guò)Tripure試劑提取得到的不同處理的不同干旱脅迫處理的鐵觀音茶樹(shù)葉片總RNA滿足Solexa測(cè)序要求，通過(guò)對(duì)干旱脅迫鐵觀音茶樹(shù)葉片RNA樣品進(jìn)行miRNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下：
　?。?）鐵觀音茶樹(shù)正常水分、輕度脅迫、中度脅迫及重度脅迫四個(gè)處理的樣品中分別獲得157

4、77773、13218397、14510362和13452128條clean reads序列，其所占總測(cè)序數(shù)據(jù)比例分別為99.86％、99.58%、99.59%、98.95%。獲得的sRNA樣品峰值為24nt，測(cè)序所得的數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。
　?。?）基于茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)的未知性，選用模式植物擬南芥基因組為參考基因組，同時(shí)與Genbank中已經(jīng)公布的茶樹(shù)基因信息及Rfam3等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到注釋的miRNA比例分別為5.60%、7.35%

5、、7.66%、15.78%。鐵觀音茶樹(shù)干旱脅迫的四個(gè)樣品中未知的sRNA數(shù)據(jù)龐大，miRNA的探究依舊存在大量的未知性。
　　（3）為進(jìn)一步鑒定茶樹(shù)miRNA,進(jìn)行鐵觀音茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，同時(shí)以鐵觀音茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組為參考數(shù)據(jù)，鑒別茶樹(shù)novel miRNA。結(jié)果表明：以鐵觀音茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組為參考數(shù)據(jù)庫(kù)比較分析后，在鐵觀音茶樹(shù)不同干旱處理樣品中共得到176條茶樹(shù)miRNA序列信息，其中分屬于5個(gè)家族的7條序列在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中可以得到相

6、應(yīng)注釋信息，絕大多數(shù)為未知miRNA序列信息或鐵觀音茶樹(shù)特有的miRNA信息。
　　（4）在鐵觀音茶樹(shù)干旱脅迫過(guò)程中絕大多數(shù)的miRNA處于低豐度狀態(tài)，低豐度表達(dá)的miRNA數(shù)量龐大，同一家族中不同miRNA成員存在表達(dá)豐度差異，對(duì)調(diào)控同一靶基因的不同miRNA間同樣也存在表達(dá)豐度的差異性。
　　（5）依據(jù)鐵觀音茶樹(shù)干旱脅迫過(guò)程中miRNA的差異表達(dá)情況，結(jié)合miRNA及其靶基因功能預(yù)測(cè)，推斷出19個(gè)miRNA可能與鐵觀音茶

7、樹(shù)干旱脅迫存在密切相關(guān)性。其中包括12個(gè)conserved miRNA：csi-miR156/159a/165a-3p/166a/166g-3p/167d/2199/398/408b-5p/535a/6170/894，7個(gè)novel miRNA：csi-miR4/7/12/18/24/26/28。
　　大多數(shù)預(yù)測(cè)得到的miRNA的靶基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子，調(diào)控目的基因在特定的時(shí)間與空間中表達(dá)。同時(shí)，在鐵觀音茶樹(shù)干旱脅迫中的miRNA也在蛋

8、白質(zhì)合成及代謝、植物器官發(fā)育及形態(tài)建成等諸多生命活動(dòng)中具有調(diào)控作用。
　　3、鐵觀音茶樹(shù)干旱脅迫過(guò)程中相關(guān)miRNA的定量表達(dá)分析
　　為研究miRNA在鐵觀音茶樹(shù)干旱脅迫過(guò)程中的表達(dá)量差異，選用鐵觀音茶樹(shù)正常供水（對(duì)照）、輕度干旱脅迫、中度干旱脅迫、重度干旱脅迫的四個(gè)處理的葉片總RNA為試驗(yàn)材料，對(duì)19個(gè)與鐵觀音茶樹(shù)干旱脅迫相關(guān)的miRNA在干旱脅迫階段的表達(dá)量情況分析后發(fā)現(xiàn)：csi-miR156、csi-miR398、c

9、si-miR7均呈現(xiàn)“上升型”表達(dá)，在鐵觀音茶樹(shù)的干旱脅迫中起正相關(guān)作用；csi-miR165a-3p、csi-miR159a、csi-miR167d、csi-miR408b-5p及csi-miR6170、csi-miR5、csi-miR12、csi-miR18、csi-miR26、csi-miR28在鐵觀音茶樹(shù)干旱脅迫過(guò)程中均呈現(xiàn)“先升后降”的表達(dá)趨勢(shì)；csi-miR166a、csi-miR166g-3p、csi-miR435a、cs

10、i-miR894、csi-miR2199、csi-miR24均呈負(fù)相關(guān)作用。
　　4、MiR166家族的靶基因克隆及定量表達(dá)分析
　　本研究采用同源克隆法，得到 miR166家族靶基因 HD-ZipIII家族成員ATHN-14-like、ATHN-15-like基因片段，片段長(zhǎng)度分別為1246bp及522bp。采用qPCR技術(shù)對(duì)ATHN-14-like、ATHN-15-like基因進(jìn)行定量表達(dá)分析，同時(shí)比照miR166a、m

11、iR166g-3p在各處理樣品中的定量表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)：
　?。?）在鐵觀音茶樹(shù)輕度脅迫、中度脅迫、重度脅迫三個(gè)樣品中，miR166a及miR166g-3p的相對(duì)表達(dá)量均較正常供水樣品呈現(xiàn)下降趨勢(shì)時(shí)，HD-ZipIII家族ATHN-14-like、ATHN-15-like基因的相對(duì)表達(dá)量較正常水分樣品則均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。
　?。?）當(dāng)miR166a、miR166g-3p在鐵觀音茶樹(shù)不同處理的干旱脅迫中呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)作用時(shí)，ATHN-