茶樹倍半萜類物質代謝及其對蟲害脅迫響應.pdf

1、萜類化合物，又稱類異戊二烯，是已知最大的一類次生代謝產物，從各類生物中發(fā)現(xiàn)的萜類物質有超過55000種。許多植物源的萜類化合物在植物與環(huán)境的相互作用中發(fā)揮重要功能。單萜、倍半萜和少數(shù)二萜、三萜分子量較小，具有較低的蒸氣壓，從而能夠以氣態(tài)形式被植物釋放，是植物種群間、植物-昆蟲間的重要化學信號媒介。本論文旨在系統(tǒng)地分析鑒定茶樹倍半萜類揮發(fā)物種類、發(fā)掘茶樹倍半萜類合成相關基因、明確倍半萜類合成酶功能，進而揭示倍半萜類物質代謝對各種脅迫的響應

2、機制。本文以茶種Camellia sinensis(L.) O.Kuntze的普洱茶變種C.sinensis var.assamica和茶變種C.sinensis var.sinensis茶樹花為材料，全面解析了茶樹組成性萜類揮發(fā)物;通過非生物和生物脅迫處理，分析了茶樹誘導性萜類揮發(fā)物。建立了2個茶樹變種的花轉錄組和蟲害誘導茶變種的葉片組織轉錄組數(shù)據(jù)庫，發(fā)掘了茶樹萜類MVA和MEP代謝途徑的關鍵基因，驗證了其功能。分離了10個茶樹萜類合

3、成酶，通過體外表達檢測了其酶活性;以擬南芥為模式植物，轉基因驗證了茶樹萜類合成酶基因1(CsTPS1功能。比較了茶樹對咀嚼式和刺吸式害蟲為害的差異響應，初步證明了茉莉素(Jasmonates，JAs)是蟲害誘導茶樹萜類代謝的主導信號。
　　具體研究結果如下:
　　1、茶花是茶樹組成性萜類物質生成的主要器官，普洱茶變種茶樹花萜烯揮發(fā)物總量很大，包括約10種左右的單萜和27種倍半萜揮發(fā)物，其中倍半萜是主要萜烯產物，但茶變種茶樹花

4、萜類物質總量非常少，僅釋放少量單萜，且主要是芳樟醇氧化物，基本無倍半萜產生。無論是種植在杭州的普洱茶變種茶樹資源，還是分布在云南各地的同類種質資源，它們花中含有的萜類成分基本一致，不受環(huán)境等因素影響，這說明普洱茶變種和茶變種茶樹花從表型和遺傳上都顯示了進化上的顯著差異。生物和非生物脅迫能夠誘導茶樹釋放萜烯揮發(fā)物，兩者的誘導效應明顯不同。蟲害十分顯著的誘導α-法尼烯α-farnesene和反式橙花叔醇trans-nerolidol，其中t

5、rans-nerolidol是其特異誘導萜烯揮發(fā)物。
　　2、建立了蟲害葉片轉錄組和茶花轉錄組數(shù)據(jù)庫，通過從頭測序(de novo)拼接發(fā)掘茶樹萜類合成相關功能基因。獲得10個全長茶樹萜類合成酶基因，其蛋白一級結構顯示8個成員是倍半萜合成酶基因，1個具有單萜合成酶特征，1個為雙萜合成酶基因。分離了茶樹萜烯MVA途徑第一步限速酶HMGS的2個基因成員CsHMGR1-2， MEP途徑第一步限速酶DXR的1個基因CsDXR。還注釋了ME

6、P途徑的2個DXS基因，JAs信號途徑作用元件相關基因COI1a-b、JAZ1-2、CsMYC2a-b等，以進一步研究茶樹萜類代謝的信號調控機制。CsHMGR1能夠被茶尺蠖和小綠葉蟬顯著誘導，說明蟲害能夠誘導該基因表達，促進萜類物質生成。CsDXR在細菌中可以顯著促進pAC-BETA質粒合成胡蘿卜素，說明它具備合成萜烯前體物的功能。從蟲害葉片轉錄組和茶花轉錄組中分離的萜類合成酶基因有序列上的同源性，有的同時存在于兩個轉錄組中，有的則只在

7、蟲害誘導條件下表達，有的則僅在花中表達，負責花香中單萜和倍半萜揮發(fā)物的合成釋放。
　　3、本研究分離的這些茶樹萜類合成酶基因，盡管它們都具有典型的植物萜類合成酶特征，但通過原核表達，酶活分析發(fā)現(xiàn)這些茶樹TPS活性普遍很弱，僅能合成微量倍半萜。根據(jù)對普洱茶變種茶樹花萜類揮發(fā)物的分析和其它植物TPS的研究經(jīng)驗判斷，茶樹的TPS可能在不同茶樹變種之間產生功能分歧，這種進化導致來源于茶變種即小葉種茶樹的TPS倍半萜合成能力退化或丟失。在小

8、菜蛾為害處理下，茶樹CsTPS1轉基因擬南芥株系的長葉烯longifolene釋放比野生型植株增加6-26倍，且抗蟲性顯著強于野生型擬南芥。分離了茶樹三萜角鯊烯合成酶基因CsSQS，原核表達和酶活性分析顯示，去除跨膜蛋白的突變CsSQS-mutant1可以縮合2分子FPP，生成角鯊烯squalene，并發(fā)現(xiàn)了1個茶花中含有大量角鯊烯的特異茶樹資源。
　　4、咀嚼式害蟲茶尺蠖和刺吸式害蟲小綠葉蟬對茶樹萜烯揮發(fā)物的誘導效應不同，茶尺蠖

9、能夠誘導茶樹釋放出單萜3-蒈烯和倍半萜橙花叔醇，而葉蟬為害則不能誘導這2種萜類揮發(fā)物，說明咀嚼式害蟲茶尺蠖對茶樹萜烯的誘導作用更明顯。當然蟲害的誘導效應受茶樹的樹齡和生長狀態(tài)、昆蟲取食能力、環(huán)境因子等因素影響。HMGR的抑制劑洛伐他汀lovastatin處理茶苗，能夠抑制蟲害后茶樹環(huán)長葉烯longicyclene和長葉烯longifolene這兩種倍半萜的釋放，證明體外信號的處理可以調控茶樹萜烯代謝。用JAs信號抑制劑布洛芬Ibupro