氫溴酸常山酮抗柔嫩艾美耳球蟲作用研究.pdf

1、球蟲病是由頂復(fù)門細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲——艾美耳球蟲引起的一種雞腸道寄生蟲病。球蟲病對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害非常嚴(yán)重，因死亡率較高，病愈雞飼料報(bào)酬下降、生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)蛋率下降以及防治用的藥物和疫苗的使用等原因，每年給世界養(yǎng)禽業(yè)造成約三十億美元的經(jīng)濟(jì)損失。目前，使用化學(xué)藥物防治是控制雞球蟲病的主要策略?；瘜W(xué)藥物能夠預(yù)防該病的爆發(fā)，但亞臨床感染相當(dāng)普遍，而且球蟲非常容易產(chǎn)生耐藥性，新藥研制費(fèi)時(shí)費(fèi)力，遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上耐藥性產(chǎn)生的速度。目前國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者在篩選各種抗球蟲

2、藥物，但一直沒有令人滿意的結(jié)果。因此，從現(xiàn)有的藥物入手，在研究其作用機(jī)理的基礎(chǔ)上再進(jìn)行新藥的研發(fā)，或許是一條好的途徑。氫溴酸常山酮自上個(gè)世紀(jì)三十年代以來就一直在使用，但對(duì)于其作用機(jī)理的研究卻相對(duì)較少，對(duì)其作用的靶點(diǎn)不甚明了。因此，我們對(duì)氫溴酸常山酮抗柔嫩艾美耳球蟲的作用開展了研究.
　　 一、華東部分地區(qū)肉雞球蟲病的流行病學(xué)調(diào)查
　　 為了了解華東地區(qū)肉雞球蟲病的流行情況，更好地為雞球蟲病的防治提供科學(xué)的依據(jù)，本項(xiàng)目組成

3、員2011年3、4月份采集了來自華東地區(qū)的浙江省、江蘇省、上海市、安徽省、山東省、江西省的養(yǎng)雞場(chǎng)的429份雞糞樣品，進(jìn)行了球蟲卵囊的分離與鑒定.結(jié)果表明，有116份陽(yáng)性樣品，多數(shù)樣品為兩三種球蟲的混合感染，六省市球蟲病平均感染率為27.1％，江西、上海、山東、江蘇四省市的球蟲病感染率為30.0％～43.3％，高于平均水平。經(jīng)單卵囊繁殖和多重PCR鑒定表明，上述六省市主要流行的球蟲種類有四種，即巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球

4、蟲和堆型艾美耳球蟲.
　　 二、氫溴酸常山酮的抗球蟲效果研究
　　 氫溴酸常山酮是一類化學(xué)合成的高效廣譜抗球蟲藥物，為了驗(yàn)證該產(chǎn)品對(duì)雞球蟲的作用效果，進(jìn)行了本試驗(yàn).本試驗(yàn)對(duì)14日齡雞進(jìn)行人工感染柔嫩艾美耳球蟲，并用1.5 mg/kg、3 mg/kg和6 mg/kg三種濃度的氫溴酸常山酮進(jìn)行治療.結(jié)果表明，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，1.5 mg/kg、3 mg/kg可以使球蟲感染雞的體重顯著提高。隨著藥物濃度增加，沒有觀察到血便排

5、出，沒有觀察到盲腸病變，但卵囊排出量和體重相對(duì)增重率都呈下降趨勢(shì)。3 mg/kg氫溴酸常山酮抗球蟲指數(shù)高達(dá)195.45，表明該氫溴酸常山酮具有高效抗球蟲效果。
　　 三、氫溴酸常山酮的安全性評(píng)價(jià)
　　 本實(shí)驗(yàn)以高于使用劑量1-3倍連續(xù)3周給藥，通過雞的增重情況、血液學(xué)與血液化學(xué)指標(biāo)及組織病理學(xué)檢查，評(píng)價(jià)了氫溴酸常山酮對(duì)雞的安全性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的血液化學(xué)指標(biāo)和血液學(xué)指標(biāo)無顯著差異，尸體解剖未見各組織器官有

6、明顯的異常變化，組織學(xué)檢查也未見有病理變化，說明氫溴酸常山酮對(duì)雞只比較安全。
　　 四、氫溴酸常山酮的體內(nèi)作用機(jī)理研究
　　 氫溴酸常山酮作為抗球蟲藥已有多年的使用歷史，但是人們對(duì)其作用的機(jī)理卻了解不多。為了研究其作用機(jī)理，本研究中分別對(duì)人工感染柔嫩艾美耳球蟲后0、1、2、3、4、5、6天的雞用3 mg/kg飼料的氫溴酸常山酮進(jìn)行治療（相應(yīng)的分別為第0、1、2、3、4、5、6組），觀察不同給藥時(shí)間的抗球蟲效果。第7組的雞

7、只感染柔嫩艾美耳球蟲而不治療，作為感染對(duì)照組，第8組的雞不感染不治療，作為陰性對(duì)照組.感染后觀察記錄各組雞的死亡率、體重增重率、卵囊下降率和盲腸病變記分，并且采集盲腸組織制備組織切片，綜合評(píng)價(jià)氫溴酸常山酮的作用效果，初步探索其作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，感染的當(dāng)天或者感染后2天之內(nèi)用氫溴酸常山酮治療是完全有效的，如果感染2天后再用氫溴酸常山酮治療只能起到部分保護(hù)效果或無保護(hù)效果.盲腸的組織切片觀察表明，氫溴酸常山酮可以抑制柔嫩艾美耳球蟲子孢

8、子的入侵，氫溴酸常山酮治療組的第二代裂殖體表現(xiàn)出空泡化和降解.因此，氫溴酸常山酮主要作用于球蟲生活史的早期，阻止其入侵宿主細(xì)胞，然后通過抑制裂殖體分裂為裂殖子，使裂殖體空泡化達(dá)到破壞其發(fā)育的作用效果，導(dǎo)致裂殖體和裂殖子發(fā)育被抑制，發(fā)育速度減慢，從而被機(jī)體的免疫系統(tǒng)清除.
　　 五、氫溴酸常山酮的體外作用機(jī)理研究
　　 為了探索氫溴酸常山酮的體外作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)對(duì)獲得的新鮮的未孢子化柔嫩艾美耳球蟲卵囊通過孢子化不同時(shí)間后給

9、予氫溴酸常山酮孵育處理，再繼續(xù)進(jìn)行孢子化，觀察了氫溴酸常山酮在體外條件下對(duì)孢子化的影響、卵囊的外觀形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的變化及部分有代表性關(guān)鍵基因的表達(dá)情況，并研究了子孢子體外處理后對(duì)細(xì)胞感染能力的影響.結(jié)果表明，氫溴酸常山酮可以抑制孢子生殖，使卵囊孢子化率降低，并且藥物處理后的卵囊脫孢子囊能力下降，卵囊表面形態(tài)和細(xì)胞質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)等都發(fā)生明顯異常，而且子孢子與氫溴酸常山酮體外條件下共孵育后對(duì)細(xì)胞的感染能力下降.根據(jù)結(jié)果推測(cè)，氫溴酸常山酮可能

10、對(duì)卵囊壁的結(jié)構(gòu)具有破壞作用.對(duì)多個(gè)基因的表達(dá)情況分析表明，氫溴酸常山酮作用后，丙醇酸激酶基因的表達(dá)下調(diào)，而1-磷酸甘露醇脫氫酶、微線體蛋白1和熱激蛋白90基因表達(dá)上調(diào)。
　　 綜上所述，本研究對(duì)華東地區(qū)部分省市的雞球蟲病進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，并用形態(tài)學(xué)方法和多重PCR方法對(duì)分離到的卵囊進(jìn)行了蟲種的鑒定;對(duì)氫溴酸常山酮進(jìn)行了抗球蟲效果實(shí)驗(yàn)及對(duì)雞的安全性實(shí)驗(yàn)，并通過氫溴酸常山酮在球蟲感染雞體后不同時(shí)間給藥探討了抗柔嫩艾美耳球蟲的作用機(jī)