柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊和子孢子差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、雞球蟲病是由艾美耳球蟲寄生于腸道所引起的一種危害嚴(yán)重的全球性寄生蟲病,給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失.目前控制球蟲病的主要方法包括化學(xué)藥物防治和疫苗免疫預(yù)防,但由于這些方法存在安全、價(jià)格以及抗藥蟲株出現(xiàn)等問(wèn)題,迫切需要尋找新的防治手段來(lái)控制球蟲病.而研制高效安全的抗球蟲病基因工程疫苗和新藥物的關(guān)鍵在于尋找到重要的蟲體抗原基因.本論文以對(duì)雞危害最為嚴(yán)重的柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)為研究對(duì)象,開展了E tenella孢子生

2、殖發(fā)育階段差異表達(dá)基因的分離、鑒定等研究,為探討雞球蟲的入侵和生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制,研制高效、安全的抗球蟲疫苗和新藥物奠定了重要基礎(chǔ). 1.利用抑制性消減雜交技術(shù)和cDNA微陣列技術(shù)篩選E, tenella孢子化卵囊和子孢子階段蟲體差異表達(dá)基因?yàn)榱朔蛛x鑒定E. tenella孢子發(fā)育階段蟲體的差異表達(dá)基因,分別以E, tenella未孢子化卵囊和孢子化卵囊為驅(qū)動(dòng)組,子孢子為實(shí)驗(yàn)組;未孢子化卵囊為驅(qū)動(dòng)組,孢子化卵囊為實(shí)驗(yàn)組,利用抑制性消減

3、雜交(SSH)技術(shù),構(gòu)建了1個(gè)E tenella子孢子與孢子化卵囊的消減cDNA文庫(kù)(ZB),1個(gè)子孢子與未孢子化卵囊的消減cDNA文庫(kù)(ZW)和1個(gè)孢子化卵囊與未孢子化卵囊的消減cDNA文庫(kù)(BW).經(jīng)PCR鑒定,2個(gè)子孢子消減cDNA文庫(kù)的重組率都為96﹪,孢子化卵囊消減cDNA文庫(kù)的重組率為98﹪,大部分插入片段都大于500 bp.從構(gòu)建好的3個(gè)消減cDNA文庫(kù)中共挑取3004個(gè)克隆制成cDNA微陣列.芯片雜交分析后獲得1371個(gè)

4、差異表達(dá)基因克隆,其中從BW消減cDNA文庫(kù)中獲得245個(gè),從ZB消減cDNA文庫(kù)中獲得582個(gè),從ZW消減cDNA文庫(kù)中獲得544個(gè).對(duì)其中727個(gè)差異表達(dá)基因克隆進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果獲得了657條有效.ESTs序列(BW文庫(kù)197條有效ESTs,ZB文庫(kù)275條,ZW文庫(kù)185條),代表118個(gè)單一基因,其中孢子化卵囊31個(gè),子孢子87個(gè).序列同源性搜索結(jié)果顯示:31個(gè)孢子化卵囊單一基因中,蛋白功能已知的有12個(gè),蛋白功能未知的有19個(gè),

5、在球蟲中已報(bào)道的有7個(gè);87個(gè)子孢子單一基因中,蛋白功能已知的有23個(gè),蛋白功能未知的有64個(gè),在球蟲中已報(bào)道的有6個(gè).從中選擇了5個(gè)差異表達(dá)基因克隆,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示與芯片雜交結(jié)果一致.BLASTX同源性比較分析后發(fā)現(xiàn):孢子化卵囊階段蟲體差異表達(dá)基因編碼的蛋白與E tenella微線蛋白、TA4抗原蛋白、表面抗原蛋白,剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)的熱激蛋白和蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶,人隱孢子蟲(Cryp

6、tosporidium.hominis)卵囊壁蛋白等有較高的同源性;子孢子階段蟲體高表達(dá)基因編碼的蛋白與惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶、鈣依賴性蛋白激酶,約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii)神經(jīng)磷脂酶C,E, tenella SERPlNl蛋白、微線蛋白、反轉(zhuǎn)錄酶等有較高的同源性.提示這些基因編碼的蛋白可能參與了卵囊孢子化的形成、蟲體的入侵、蟲體在宿主細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育、蟲體與宿

7、主細(xì)胞的相互作用、細(xì)胞代謝、免疫調(diào)節(jié)及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等.本研究為分析鑒定雞球蟲孢子發(fā)育階段蟲體差異表達(dá)基因,探討與雞球蟲入侵和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的作用機(jī)制等奠定了基礎(chǔ). 2.E.tenella孢子化卵囊和子孢子差異表達(dá)新基因全長(zhǎng)cDNA的克隆與分析根據(jù)差異表達(dá)基因的ESTs序列,利用RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得8個(gè)E.tenella新基因的全長(zhǎng)cDNA,其中包括5個(gè)孢子化卵囊新基因全長(zhǎng)cDNAs(編號(hào)為:BW1-A05、BW1-E06、BW

8、3-F04、BW3-D10、BW11-H07;Genbank登錄號(hào):EF552212、EF552214、EF552213、EF552211、EF552218),3個(gè)子孢子新基因全長(zhǎng)cDNAs(編號(hào)為:ZB1-A02、ZB1-A08、ZB11-A04;Genbank登錄號(hào):EF552216、EF552217、EF552215).利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)新基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、抗原位點(diǎn)等進(jìn)行了分析預(yù)測(cè),對(duì)編碼蛋白的保守功能域、結(jié)

9、構(gòu)位點(diǎn)及同源性蛋白進(jìn)行了搜索,結(jié)果顯示4個(gè)基因編碼的蛋白與其它頂復(fù)器原蟲蛋白有較高的同源性,其中孢子化卵囊高表達(dá)基因BW11-H07編碼的蛋白與T.gondii的假想蛋白有較高的同源性;BW1-E06基因編碼的蛋白與推測(cè)的T.gondii蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(putative PDI-like protein)有較高的同源性;子孢子階段高表達(dá)基因ZB11-A04編碼的蛋白與T.gondii 天冬氨酸蛋白酶3(toxomepsin 3)有較

10、高同源性;ZB1-A02基因編碼的蛋白與嬰兒利氏曼原蟲 (Leishmania infantum)蛋白激酶有較高的同源性;其余基因編碼的蛋白可能是E.tenellct特有的蛋白.本研究為雞球蟲候選基因工程疫苗靶分子和新治療藥物靶標(biāo)的篩選提供了重要的參考依據(jù). 3.E.tenella 新基因在大腸桿菌中的表達(dá)將獲得的E.tenella差異表達(dá)新基因 (BW1-E06、BW3-F04、ZB1-A02、ZB1-A08) 全長(zhǎng)cDNA連

11、接到原核表達(dá)載體pGEX-4T-2中,成功構(gòu)建了4個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-E06 (4T-E06)、pGEX-4T-F04(4T-F04)、pGEX-4T-A02 (4T-A02)、pGEX-4T-A08 (4T-A08),并在大腸桿菌BL21(DE3)中成功誘導(dǎo)表達(dá),純化獲得4個(gè)重組融合蛋白(GST-E06、GST-F04、GST-A02、GST-A08),其中4T-E06表達(dá)的融合蛋白大部分以可溶性蛋白形式出現(xiàn),其余3個(gè)重組質(zhì)

12、粒表達(dá)的融合蛋白都以包涵體形式存在,利用GST resin成功純化了4個(gè)重組融合蛋白.Western-blot分析結(jié)果表明4個(gè)重組蛋白都具良好的抗原性.進(jìn)一步深入研究這些基因以及編碼蛋白的功能,對(duì)研制雞球蟲候選疫苗和新治療藥物都具有重要意義. 4.E.tenella重組蛋白免疫保護(hù)效果的初步研究為評(píng)價(jià)本研究研制的幾種基因重組抗原在雞體中誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果,將重組表達(dá)抗原GST-E06、GST-A02、空載體pGEX-4T-2表達(dá)

13、蛋白GST分別設(shè)高(100μg)、中(50μg)、低(25μg)三個(gè)免疫劑量加弗氏佐劑肌肉免疫雞.同時(shí)將4T-E06、4T-A02、4T-A08、4T-F04重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的活菌和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的活菌分兩個(gè)劑量(150μg和300 μg)口服免疫雞.分別于7、17和27日齡三次免疫雞,31日齡時(shí)經(jīng)口攻擊感染E.tenella 2×10<'4>個(gè)卵囊/只.結(jié)果顯示:1)增重:所有免疫組雞增重量均低于不免疫不攻蟲組,重組蛋白免疫組增重最多

14、的是4T-A02(50μg)免疫組,其相對(duì)增重率為80.7﹪;口服活菌免疫組,增重較多是重組表達(dá)菌4T-A08(300μg)和4T-A02(150μg)劑量免疫組,相對(duì)增重率為83.3﹪和81.7﹪,與不免疫攻蟲組(73.2﹪)相比差異顯著(p<0.05).2)卵囊產(chǎn)量:重組蛋白免疫組卵囊產(chǎn)量最低的為4T-E06(50μg)免疫組,相對(duì)卵囊產(chǎn)量為63.6﹪;口服活菌免疫組的卵囊產(chǎn)量最低的為4T-A02(300μg)免疫組,相對(duì)卵囊產(chǎn)量為

15、66.6﹪;3)腸道病變記分:重組蛋白免疫組病變記分與不免疫攻蟲組差異不明顯,但50μg免疫劑量組的病變記分都低于不免疫攻蟲組,其中最低的免疫組為4T-A02(50μg);口服免疫組病變記分都低于不免疫攻蟲組的病變記分,其中最低的免疫組為4T-A02(300 μg),與不免疫攻蟲組差異顯著(p<0.05).深入對(duì)這些重組抗原的遞呈、免疫佐劑以及不同免疫組合等方面進(jìn)行研究,同時(shí)進(jìn)一步對(duì)其它孢子發(fā)育階段差異表達(dá)基因及其基因產(chǎn)物誘導(dǎo)對(duì)雞抗球蟲