海水細菌分泌性蛋白的篩選、分析及其在載體疫苗中的應(yīng)用.pdf

1、據(jù)統(tǒng)計，目前已發(fā)現(xiàn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病不少于5000種，其中，細菌性疾病成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見、最嚴(yán)重的病害之一，常給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，因而針對病原菌的免疫防治研究具有切實意義。在傳統(tǒng)的解決方案中，以抗生素和優(yōu)質(zhì)飼養(yǎng)的解決方案在一定程度上發(fā)揮了積極作用，但長期頻繁使用抗生素及其它一些化學(xué)藥物會引起環(huán)境中包括致病性和非致病性微生物產(chǎn)生耐藥性、水產(chǎn)動物體內(nèi)藥物殘留及對水環(huán)境的污染等弊端。因而，以微生物疫苗為主的免疫防治有不可替代的優(yōu)勢。

2、目前，在微生物疫苗的研制中，活細菌疫苗載體的研制成為熱點，主要集中在食品、藥品的研發(fā)當(dāng)中，在水產(chǎn)動物的免疫防治方面還鮮有報道。本文從改造重組表達載體提高目的蛋白表達量著手，構(gòu)建了能夠高效表達外源蛋白的可視化高效表達載體，然后又分析篩選出了水產(chǎn)動物源性細菌的分泌性蛋白及其分泌性信號肽序列，進而可以將獲得的蛋白序列分析后用以分泌型高效表達載體的構(gòu)建，并將構(gòu)建的載體用于基因的大量表達、有益菌載體表達的口服疫苗研制以及有價值蛋白的動物腸道表達。

3、
　　 本研究主要包括2部分內(nèi)容。
　　 第一部分：一種改造重組表達載體提高目的蛋白表達量方法的初步研究。這部分研究中，我們首次利用PCR方法在商品化的表達載體pGFPuv起始密碼子后插入人工合成的編碼多密碼子氨基酸的寡核苷酸序列將原始的綠色熒光蛋白表達載體pGFPuv進行了修改，通過誘導(dǎo)表達和SDS-PAGE分析了原表達載體和修改的表達載體對GFP的表達差異。結(jié)果表明，IPTG誘導(dǎo)后原載體pGFPuv和修改的phGFP

4、uv載體在大腸桿菌DH50中均能正常表達出綠色熒光蛋白，但原pGFPuv載體對GFP的表達量不足細菌總蛋白的9％，而修改的phGFPuv載體對GFP的表達量占到了細菌總蛋白的20％以上。證明了在表達載體或目的基因起始密碼子后插入編碼多密碼子氨基酸的寡核苷酸序列可以使蛋白的表達量提高2-5倍。
　　 第二部分：水產(chǎn)動物源性細菌主要分泌性蛋白的鑒定及其分泌性序列的分析。從本實驗室保種的常見的水產(chǎn)動物病原菌鰻弧菌(V.anguilla

5、rum)MN、鰻弧菌(V.anguillarum)3101、費氏弧菌(V.fischeri)及對蝦腸道中分離的非病原菌堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)培養(yǎng)液中分別獲取了分泌性蛋白，進行SDS-PAGE，對表達量較高的8條蛋白區(qū)帶進行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定表明，它們分別是鰻弧菌MN金屬蛋白酶(empA-MN)、鰻弧菌3101金屬蛋白酶(empA-3101)、鋅金屬蛋白酶(zincempA)、費氏弧菌VFMJ11_1

6、094蛋白(VFMJ11_1094)、費氏弧菌ES114的外膜蛋白(OMP)、堅強芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶(chitinase)、堅強芽孢桿菌腸毒素A(enterotoxinA)和堅強芽孢桿菌BCG9842蛋白(hypotheticalproteinBCG9842)。根據(jù)所鑒定的序列設(shè)計引物，分別從鰻弧菌MN、鰻弧菌3101費氏弧菌和堅強芽孢桿菌中擴增出相應(yīng)基因，克隆后，測定了empA、empA2、zincempA、VFMJ11-1094、OM

7、P、chitinase、enterotoxinA和BCG9842相應(yīng)基因的序列，經(jīng)在線軟件SignaIP3.0分析，確定empA、empA2、zincempA、VFMJ11-1094、OMP、chitinase、enterotoxinA和BCG9842均存在不同的分泌性信號肽序列angMN-35、ang3101-35、ang3101-25、vf-38、vf-23、bf-43、bf-37和bf-16，通過在線軟件PSORT分析表明，所有信