環(huán)境友好型生物醫(yī)學(xué)材料的綠色制備及其應(yīng)用.pdf

1、醫(yī)療廢物危害大、處理難，基于綠色化學(xué)“源頭削減”的原則，采用生物可降解材料制備醫(yī)用產(chǎn)品可減少醫(yī)療廢物產(chǎn)量、降低醫(yī)療廢物處理難度。生物相容性好、無免疫原性、可生物降解的膠原蛋白是一種重要的生物可降解材料，膠原蛋白三維生物醫(yī)用海綿可以為細(xì)胞粘附、遷移、增殖和分化提供支撐，從而調(diào)控細(xì)胞功能、誘導(dǎo)新組織形成，在醫(yī)用領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。
　　本論文通過一種綠色環(huán)保無污染的方法制備安全可靠的重組人源膠原蛋白，以此為關(guān)鍵原料，以天然多糖殼聚糖、天

2、然交聯(lián)劑原花青素(PA)為輔助元素，制備孔徑可控的三維多孔生物醫(yī)用海綿并研究其生物學(xué)活性。主要內(nèi)容包括基因工程菌高密度發(fā)酵，分離、純化，獲得環(huán)境友好型生物可降解材料重組人源膠原蛋白;優(yōu)化調(diào)控原花青素交聯(lián)重組人源膠原蛋白-殼聚糖生物醫(yī)用海綿制備條件，研究其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用;并通過污水處理和菌渣資源化處理實(shí)現(xiàn)膠原蛋白的清潔生產(chǎn)。
　　(1)利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的人源膠原蛋白基因工程菌，在100L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵。通過代謝調(diào)控，實(shí)現(xiàn)目的蛋

3、白的高效積累，結(jié)果如下:菌體平均濕重達(dá)449.2±12.2g/L，菌體干重達(dá)150.2±2.9g/L，總蛋白濃度達(dá)32.17±1.55g/L，重組人源膠原蛋白二聚體(RHC)濃度達(dá)16.87±0.70g/L。利用組合分離、純化技術(shù)獲取RHC原料。低溫高速離心實(shí)現(xiàn)固液分離，再通過透析、超濾膜分離純化方式制備RHC，結(jié)果如下:高效液相色譜(HPLC)檢測RHC純度達(dá)98.08％，回收率達(dá)96.19％;SDS-PAGE電泳標(biāo)定RHC分子量為1

4、12kD、SEM檢測RHC纖維直徑約為3μm～5μm，紫外-可見分光光譜(UV-vis)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、核磁共振(NMR)分析證明RHC具有Ⅲ型膠原蛋白的特征結(jié)構(gòu);差示掃描量熱法(DSC)分析表明RHC的變性溫度為40.68℃。
　　(2)從細(xì)胞水平對RHC進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測。結(jié)果如下:水溶性四唑鹽(WST-1)檢測結(jié)果表明細(xì)胞在RHC體系中存活率90％左右;吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙熒光染色表明人臍靜脈內(nèi)

5、皮細(xì)胞（HUVEC）細(xì)胞保持完整細(xì)胞膜，正常生長并增殖。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明RHC是一種生物相容性良好的生物材料。
　　(3)選擇原花青素(PA)作為交聯(lián)劑，采用兩種交聯(lián)模式（浸泡法、預(yù)交聯(lián)法）組裝生物醫(yī)用海綿。
　?、貾A浸泡交聯(lián)法:通過調(diào)控RHC和殼聚糖比(1∶4～4∶1)、溶液濃度(1.0％～2.0％，wt％)、相變條件（冷凍速度0.7℃/min～4.1℃/mmin，冷凍終溫-20℃～-60℃）等參數(shù)制備生物醫(yī)用海綿;以0

6、.5％(wt％)PA，0.3M、pH值6.81的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)為交聯(lián)劑，對不同條件下制備的多組生物醫(yī)用海綿進(jìn)行浸泡交聯(lián)。
　　②PA預(yù)交聯(lián)法:在RHC和殼聚糖比1∶1、溶液濃度1.0％（wt％）、冷凍速率4.1℃/min冷凍干燥條件下，預(yù)交聯(lián)條件為PA濃度0.3％（wt％），PBS中和濃度0.2M、pH值6.24。PA預(yù)交聯(lián)法制備的生物醫(yī)用海綿:孔徑115.01±3.1μm，孔隙率86.4±1.1％，溶脹率39.3±1.

7、8;壓縮模量889±2KPa;熱失重48.99％（升溫至500℃）;膠原酶和溶菌酶混合酶液降解7天后，降解率約為30％，抗酶解率得到有效提高。
　　(4)從細(xì)胞水平考察細(xì)胞與生物醫(yī)用海綿的相互作用。利用三維培養(yǎng)技術(shù)，通過WST-1檢測、AO/EB雙熒光染色技術(shù)，考察HUVEC細(xì)胞在醫(yī)用海綿中的生存狀況。結(jié)果如下:孔徑較小的生物醫(yī)用海綿對HUVEC的促增殖能力更強(qiáng);HUVEC在PA預(yù)交聯(lián)法制備的生物醫(yī)用海綿中進(jìn)行三維培養(yǎng)，相比PA浸

8、泡交聯(lián)海綿培養(yǎng)，細(xì)胞粘附更好、增殖更快，并且在生物醫(yī)用海綿內(nèi)部遷移。
　　利用HUVEC細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對內(nèi)皮細(xì)胞-PA預(yù)交聯(lián)生物醫(yī)用海綿相互作用相關(guān)蛋白基因表達(dá)水平變化進(jìn)行檢測。結(jié)果表明:HUVEC在生物醫(yī)用海綿中三維培養(yǎng)，其CD31、VEGF、Integrinβ1、COLⅠ、MMP1等與血管化相關(guān)蛋白基因表達(dá)水平均比二維培養(yǎng)及殼聚糖生物醫(yī)用海綿三維培養(yǎng)高，說明PA預(yù)交聯(lián)生物醫(yī)用海綿能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血

9、管化相關(guān)基因的表達(dá)。
　　(5)高密度發(fā)酵和分離、純化過程中產(chǎn)生的污水處理。
　　通過污水處理、菌渣資源化處理實(shí)現(xiàn)無污染生產(chǎn)。對生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的污水進(jìn)行A2O2（厭氧-缺氧-二級好氧）-絮凝沉淀組合工藝處理，并對處理前后的污水根據(jù)《酵母工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》和《GB21903-2008發(fā)酵類制藥工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測和毒理試驗(yàn)。結(jié)果表明，處理后的污水達(dá)到排放要求，特別是氨氮降至3.76mg/L，總氮含量降至2

10、5.5mg/L，總磷含量有效降低至0.222mg/L，脫氮除磷效果明顯。毒理Ames試驗(yàn)表明，發(fā)酵液和處理后污水均對鼠傷寒沙門氏菌無明顯的誘變活性，保證了排入環(huán)境的安全性。
　　(6)高密度發(fā)酵產(chǎn)生的固廢菌渣資源化處理。
　　從發(fā)酵廢棄物的畢赤酵母菌中提取幾丁質(zhì)-葡聚糖混合多糖(CGC)，以提高菌渣的綜合利用，CGC生物相容性好，具有抗氧化、抗菌、抗炎等特性，是一種可應(yīng)用于化妝品、生物醫(yī)藥等的高附加值產(chǎn)品。通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)(B