用于蛋白質(zhì)研究的新型四苯基乙烯衍生物的設(shè)計與合成.pdf

1、在研究生物分子的眾多技術(shù)中，熒光技術(shù)提供了一種直觀、可實時、原位和非侵入性的觀察，而且可以在分子水平上分析生物分子，研究復雜的生物結(jié)構(gòu)和過程。到目前為止，已有多種多樣的熒光材料被用于生物傳感器或生物成像領(lǐng)域。其中聚集誘導發(fā)光（Aggregation-Induced Emission，AIE）分子具有與傳統(tǒng)熒光分子不同的發(fā)光行為，其在溶液狀態(tài)下熒光微弱而分子內(nèi)運動受限時熒光增強的獨特性能使其可被用于很多傳統(tǒng)熒光材料應用受限的領(lǐng)域，且表現(xiàn)出

2、眾。因此設(shè)計開發(fā)新型的AIE分子并探索其在生物檢測和成像中的應用成為一個前沿的、重要的研究課題。除了具備AIE性能，用于生物檢測與成像的熒光分子還需要滿足一些特殊要求，如水溶性、紅光發(fā)射、細胞相容性等，而現(xiàn)有適用于生物傳感和成像的AIE分子依然有限。此外，生物分子的種類繁多，現(xiàn)有生物探針僅適用其中極少一部分，還有許多生物分子亟待研究者們設(shè)計新型的特異性探針加以檢測。本論文以AIE型熒光探針設(shè)計合成為核心，以種類最多、結(jié)構(gòu)最復雜、功能最豐

3、富的生物分子——蛋白質(zhì)作為研究對象，選取其中的典型結(jié)構(gòu)開展研究。
　　氨基酸是蛋白質(zhì)的構(gòu)筑基元，盡管AIE型熒光分子在帶有巰基、羥基和酸性殘基的氨基酸檢測中已有文獻報道，但對堿性殘基氨基酸的檢測還是空白。本文通過用乙烯雙鍵連接AIE生色團四苯基乙烯(TPE)和1，3-茚滿二酮（IND）的分子設(shè)計，利用橋聯(lián)雙鍵在氫氧根離子的作用下發(fā)生水解反應導致TPE-IND分子原有的橙紅色發(fā)光減弱的現(xiàn)象，實現(xiàn)對兩種堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸）區(qū)別

4、于其它常見氨基酸的檢測。進一步研究發(fā)現(xiàn)，檢測反應的產(chǎn)物在紫外光的作用下具有藍色熒光逐漸增強的行為。TPE-IND分子對氫氧根離子和紫外光兩種刺激同時具有熒光響應的特點使其可被用作一種雙響應的熒光探針。
　　血清蛋白是最典型的輸運蛋白，其折疊—解折疊過程在功能發(fā)揮中起決定性的作用，本文選取牛血清蛋白(BSA)作為研究模型體系。用AIE-型熒光探針研究包括BSA在內(nèi)的血清蛋白的構(gòu)象變化有若干前期報道。本文采用陰/陽離子型AIE熒光探針

5、相結(jié)合的方法取得了新的研究結(jié)果，除了進一步證明AIE-型熒光探針的可靠性、靈敏性、親/疏水作用在探針與BSA結(jié)合中的主導作用以及血清蛋白解折疊存在“熔球”中間態(tài)之外，貢獻了新的認識:(1)明確了一個正常折疊的蛋白質(zhì)分子僅結(jié)合一個探針分子，而且不論陰離子還是陽離子型探針都結(jié)合在亞區(qū)ⅡA這一特定的區(qū)域的結(jié)合方式。(2)通過對陰/陽離子探針與BSA形成的兩種復合物在溫度、變性劑等誘導下的解折疊和重新折疊行為進行對比研究，發(fā)現(xiàn)在親/疏水主導作用

6、之外，靜電作用也有重要影響。(3)解折疊過程中，亞區(qū)ⅡA的輸水空腔被破壞，探針分子被釋放出來而使體系熒光減弱。同時原本處于蛋白質(zhì)內(nèi)部的亞區(qū)Ⅰ暴露到環(huán)境中，并傾向于結(jié)合陽離子型的熒光探針，從而導致陽離子型探針的熒光增強而陰離子型探針的熒光減弱。
　　多肽是構(gòu)成蛋白質(zhì)的功能片段，具有水溶性、細胞相容性和細胞膜透過性等功能。本文設(shè)計合成了一系列基于TPE的、帶有功能性多肽鏈的AIE-gen，在緩沖液中研究了各種AIE-gen的的臨界聚集

7、濃度和分散與聚集形態(tài)。利用Hela細胞驗證了各種探針分子的細胞成像能力。在選用的三種多肽鏈中，含有較多堿性氨基酸殘基的肽鏈與四苯基乙烯衍生物構(gòu)成的探針能在高濃度下以粒子的形式較好的通過細胞膜分散到細胞質(zhì)中，并使細胞質(zhì)產(chǎn)生強烈的藍色熒光。三氰基呋喃基團及肽鏈修飾的四苯基乙烯分子發(fā)光波長在紅光波段范圍，能順利進入到細胞中，并使細胞質(zhì)具有極強的紅色熒光信號。這表明具有特定序列的多肽其修飾的四苯基乙烯衍生物能夠?qū)⒎肿舆\輸?shù)郊毎麅?nèi)，達到對細胞進行

8、熒光成像的效果。同時可以通過對四苯基乙烯衍生物發(fā)光性能的調(diào)控，實現(xiàn)紅色熒光成像的效果。
　　設(shè)計合成了分別以小分子抑制劑和AIE分子為識別單元和信號單元的、針對特定蛋白酶的熒光探針。選用兩種抑制劑結(jié)構(gòu):一個能夠結(jié)合各類絲氨酸蛋白酶，另一個結(jié)合特定絲氨酸蛋白酶。選用的AIE-gen包括藍色熒光的TPE和橙色熒光的乙烯基吡啶修飾的TPE衍生物。初步結(jié)果顯示結(jié)合酶前后探針熒光光譜沒有明顯變化。通過測定蛋白酶水解特定底物速率的變化，觀測探