結(jié)直腸癌抗原特異性T細(xì)胞擴(kuò)增與制備的關(guān)鍵技術(shù)研究.pdf

1、目的:結(jié)直腸癌(CRC)在我國的發(fā)病率和致死率呈不斷上升趨勢(shì)。包括免疫治療在內(nèi)的綜合治療在結(jié)直腸癌治療中起到越來越重要的作用。通過多種方式用腫瘤抗原刺激自體淋巴細(xì)胞獲得抗原特異性殺傷細(xì)胞的研究眾多，腫瘤細(xì)胞表面的抗原被抗原提呈細(xì)胞(APC)加工成抗原肽與主要組織相容復(fù)合物(MHC)分子形成復(fù)合物提呈給T細(xì)胞并誘導(dǎo)其活化，形成腫瘤抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅡ型受體（TGFβRⅡ）和O位N-乙酰葡萄糖胺糖基轉(zhuǎn)移

2、酶(OGT)基因的框移突變產(chǎn)生的兩種新生抗原具有HLA-A2限制性，存在于20-40％的HLA-A2限制性結(jié)直腸癌患者且不存在于正常人和其他腫瘤患者，提呈后的抗原肽分別為TGFβRⅡ（RLSSCVPVA，131-139）和OGT（SLYKFSPFPL，28-37）。腫瘤為了逃避識(shí)別，下調(diào)甚至不表達(dá)MHC分子，部分腫瘤患者免疫細(xì)胞數(shù)下降功能低下都會(huì)造成腫瘤抗原無法提呈，導(dǎo)致T細(xì)胞無法活化。針對(duì)上述T細(xì)胞無法活化的現(xiàn)狀，我們?nèi)斯ず铣煽乖牟?/p>

3、與患者的外周血T細(xì)胞共培養(yǎng)，以提高結(jié)腸癌特異性T細(xì)胞的活化效率。接下來，用樹突狀細(xì)胞(DC)結(jié)合抗原肽誘導(dǎo)活化殺傷性T細(xì)胞與抗原肽直接刺激活化細(xì)胞比較殺傷效能，以期獲得同等或者更好的殺傷效果且減少體外對(duì)細(xì)胞操作，降低副反應(yīng)發(fā)生率。綜上所述，本課題旨在構(gòu)建簡(jiǎn)便有效的腫瘤特異性T細(xì)胞的制備方法，以達(dá)到增強(qiáng)特異性同時(shí)降低更加安全的目的。
　　方法:合成TGFβRⅡ(RLSSCVPVA，131-139)和OGT（SLYKFSPFPL，28

4、-37）兩段抗原肽，質(zhì)譜分析進(jìn)行純度鑒定;篩選獲得表達(dá)TGFβRⅡ(RLSSCVPVA，131-139)和OGT(SLYKFSPFPL，28-37)且具有HLA-A2限制性的結(jié)腸癌細(xì)胞系一株:DLD-1。選擇具有HLA-A2限制性的結(jié)直腸癌患者，應(yīng)用密度梯度離心法和細(xì)胞因子刺激方式分離外周血培養(yǎng)獲得結(jié)直腸癌患者CD8+T細(xì)胞為主的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)混懸液，流式細(xì)胞分析鑒定刺激培養(yǎng)前后細(xì)胞表型及比例;使用抗原肽與CD8+T細(xì)胞共

5、培養(yǎng)刺激活化產(chǎn)生抗原特異性CTL，MTS實(shí)驗(yàn)測(cè)定針對(duì)DLD-1結(jié)腸癌細(xì)胞系不同效靶比的殺傷效應(yīng)，ELISA方法評(píng)估了各組IFN分泌情況以進(jìn)一步評(píng)估CTL活化和殺傷能力。
　　其次，表達(dá)HLA-A2分子健康人的PBMC誘導(dǎo)獲到成熟DC附載抗原肽刺激相應(yīng)個(gè)體T細(xì)胞活化形成抗原特異性CTL，比較DC疫苗誘導(dǎo)的CTL與直接使用抗原肽刺激的CTL殺傷活性。
　　結(jié)果:我們獲得的TGFβRⅡ(RLSSCVPVA，131-139)和OGT

6、（SLYKFSPFPL，28-37）抗原肽，純度≥99％，分別加入到表達(dá)HLAA2分子的結(jié)直腸癌患者和健康人PBMC，DC進(jìn)而誘導(dǎo)形成的抗原肽特異性CTL，經(jīng)MTS試驗(yàn)證實(shí)經(jīng)抗原肽刺激2的結(jié)直腸癌患者T細(xì)胞混懸液在第殺傷實(shí)驗(yàn)3天效靶比為5/1，10/1，20/1分別獲得對(duì)DLD-1的48.54％，63.62％和70.23％殺傷率，低于健康對(duì)照組的殺傷率為66.32％，74.82％和81.61％，僅在10/1條件下無抗原肽處理患者組的殺傷

7、能力優(yōu)于健康對(duì)照，說明抗原肽刺激無法提高結(jié)腸癌患者自體免疫細(xì)胞殺傷DLD-1的能力。另外，與DC細(xì)胞負(fù)載抗原肽誘導(dǎo)形成的腫瘤抗原肽特異性CTL相比，直接使用抗原肽刺激正常人的T細(xì)胞為主的PBMC誘導(dǎo)得到的特異性CTL能夠?qū)LD-1獲得更好的殺傷效果:與DC負(fù)載抗原肽誘導(dǎo)形成的腫瘤抗原肽特異性CTL相比，直接刺激獲得的特異性CTL第14天在效靶比為5/1時(shí)，DC負(fù)載抗原肽1(OGT)與抗原肽1直接刺激獲得的CTL對(duì)DLD-1的殺傷率分別

8、為26.71％和65.84％(P=0.054)，DC負(fù)載與抗原肽2（TGFβRⅡ）直接刺激的CTL對(duì)DLD-1的殺傷率分別為20.69％和81.32％(P=0.039)，DC負(fù)載與抗原肽1+2直接刺激的CTL對(duì)DLD-1的殺傷率分別為39.91％和69.24％(P=0.048)。在效靶比為10/1時(shí)，DC負(fù)載與抗原肽直接刺激的CTL對(duì)DLD-1的殺傷率分別為36.33％和88.82％(P=0.038)，DC負(fù)載與抗原肽2直接刺激的CTL