白血病腫瘤相關(guān)抗原特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞的體外擴(kuò)增及殺傷功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探索體外擴(kuò)增白血病腫瘤相關(guān)抗原特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞（tumor-associated antigen-specific cytotoxic T lymphocytes,TAA-CTLs）的可行性，并在體外驗(yàn)證其特異性殺傷作用。
　　方法：與健康志愿者簽署知情同意書后，采集正常健康志愿者外周血10-20ml，采用密度梯度離心法，利用人淋巴細(xì)胞分離液得到外周血單個(gè)核細(xì)胞，顯微鏡（5×）下計(jì)數(shù)單個(gè)核細(xì)胞數(shù)。采用“細(xì)胞因子雞尾酒法”【

2、rIL-4（400U/ml），GM-CSF（800U/ml），PGE-2（1ug/ml），TNF-α（10ng/ml），rIL-1β（10ng/ml)、rIL-6（100ng/ml）】誘導(dǎo)培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DCs），倒置顯微鏡觀察并采集成熟DC形態(tài)，流式細(xì)胞儀分析成熟及非成熟DCHLA-DR及CD86表型差異。成熟的DC負(fù)載白血病相關(guān)抗原WT1、PRAME、NY-ESO-1混合多肽，后與自體T淋巴細(xì)胞共培育

3、，擴(kuò)增出TAA-CTL；同時(shí)設(shè)置未經(jīng)多肽致敏的DC與自體T淋巴細(xì)胞共培育，擴(kuò)增出 CTLs作為對(duì)照組。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè) TAA-CTLs表型及多種細(xì)胞因子的分泌率(IFN-γ、TNF-a、IL-2、IL-4、IL-10)，細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TAA-CTLs對(duì)負(fù)載腫瘤相關(guān)抗原的自體靶細(xì)胞的殺傷力。
　　結(jié)果：1）外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng) GM-CSF、IL-4聯(lián)合作用3天后細(xì)胞發(fā)展為不規(guī)則形態(tài)并聚集成團(tuán)，部分細(xì)胞由貼壁狀態(tài)變?yōu)閼腋顟B(tài)。培養(yǎng)

4、7天誘導(dǎo)成熟后，鏡下見大部分細(xì)胞變?yōu)閼腋顟B(tài)，細(xì)胞體積變大，形態(tài)不規(guī)則且有大量毛刺狀突起。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明經(jīng)成熟誘導(dǎo)后的成熟DC細(xì)胞表面HLA-DR和CD86的表達(dá)明顯上調(diào)。
　　2）體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的TAA-CTLs擴(kuò)增倍數(shù)為3.81±1.61，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其中CD3+細(xì)胞平均為（97.22±0.71)％，CD3+CD4+占(41.47±27.08)%，CD3+CD8+占(56.40±11.15)%，CD3-CD56+占(0.5

5、0±0.31)%，CD19+僅占(0.14±0.20)%，與對(duì)照組細(xì)胞表型分析比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TAA-CTLs分泌的多種細(xì)胞因子，如圖4所示：與對(duì)照組相比，TAA-CTLs中，IFN-γ和TNF-a的分泌明顯增高。其中CD8+TAA-CTLs中IFN-γ和TNF-a的分泌率分別為（27.67±2.21）%和（34.2±0.71）%；CD4+TAA-CTLs中IFN-γ和TNF-a的分泌

6、率分別為（21.6±2.55）%和（9.97±3.44）%。而對(duì)照組中，CD8+CTLs細(xì)胞中，IFN-γ和TNF-a的分泌率分別為（1.36±0.04）%、(5.58±0.03)%；CD4+CTLs細(xì)胞中，IFN-γ和TNF-a的分泌率分別為（0.91±0.06）%和（1.60±0.07）%，均明顯低于TAA-CTLs組（P＜0.01）。相反，與對(duì)照組相比，CD4+TAA-CTLs【（0.97±0.08）%vs（6.44±0.37）%

7、】）和CD8+TAA-CTLs【（0.97±0.11）%vs（6.37±0.18）%】中，IL-4的分泌明顯降低（P＜0.01）。而IL-10的分泌率兩組間無明顯差異。CD107a是T細(xì)胞活化的重要標(biāo)志，與細(xì)胞脫顆粒作用密切相關(guān)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，CD8+TAA-CTLs中，CD107a的表達(dá)率明顯升高【（27.95±0.55）% vs(18.55±0.35)%】（P＜0.01），而CD4+TAA-CTL中CD107a的

8、表達(dá)與對(duì)照組無明顯差異【（11.3±0.17）% vs（13.5±0.12）%】4）TAA-CTLs在效靶比為5:1、10:1、20:1、40:1時(shí)對(duì)負(fù)載TAA的自體靶細(xì)胞的殺傷率分別為（26.85±5.25）%、（60.55±2.45）%、（67.4±3.60）%、（77.00±1.00）%，對(duì)未負(fù)載TAA的自體靶細(xì)胞未見明顯殺傷作用（p＜0.01）。
　　結(jié)論：來源于健康志愿者的外周血單個(gè)核細(xì)胞體外可以成功誘導(dǎo)擴(kuò)增出 TAA-