環(huán)境友好纖維素酶在離子液體-溶劑體系中的應用基礎研究.pdf

1、生物質(zhì)資源的開發(fā)利用是實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的重要手段。纖維素是地球上最為豐富的生物質(zhì)資源之一，離子液體(IL)預處理及原位酶解作為實現(xiàn)纖維素資源有效利用的最新手段，受到廣泛關(guān)注。然而，當前研究大多使用商品化的真菌纖維素酶，缺少對細菌纖維素酶的開發(fā)與利用;同時，IL存在價格昂貴、抑制酶活等缺點。為了克服這些問題，進而提高纖維素原位酶解的可行性，本文主要開展了以下研究:
　　首先，從蘇州上方山國家森林公園土壤樣品中分離得到110株細菌，通過

2、羧甲基纖維素鈉平板初篩和產(chǎn)酶能力比較，得到一株產(chǎn)纖維素酶能力強的菌株，編號為LLZ1。該菌所產(chǎn)纖維素酶以1.00g/L微晶纖維素為底物，水解24h后葡萄糖產(chǎn)量達0.13g/L。通過形態(tài)觀察和16srRNA基因序列比對，鑒定該菌屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillu)，與P.cellulosilyticus同源性最高(99％)。
　　其次，在獲得纖維素酶產(chǎn)生菌LLZ1的基礎上，將二甲亞砜(DMSO)/IL這一更優(yōu)良的二元預處理溶

3、劑引入纖維素原位酶解體系?？疾?種DMSO/IL組合的應用效果后，構(gòu)建并優(yōu)化了一套新型水-DMSO/[EMIM]DEP-纖維素酶原位酶解體系。最優(yōu)條件下微晶纖維素和甘蔗纖維素的轉(zhuǎn)化率分別提高了39.3％和37.6％。DMSO/IL二元溶劑的應用，使IL用量減少70.0％，降低了工藝成本。該體系中LLZ1纖維素酶的最優(yōu)反應條件為40℃、pH6.0，與現(xiàn)有其他原位酶解體系相比，反應溫度低，pH近中性。因此LLZ1纖維素酶具備節(jié)約能耗、環(huán)境友

4、好的特點。
　　最后，針對纖維素酶活性普遍受IL抑制的問題，以LLZ1纖維素酶為研究對象，探究天然多樣性的纖維素酶在IL體系中的失活機制及改善方法。首先分別以不同纖維素為底物，測定各濃度[EMIM]DEP對酶活的抑制效果，結(jié)果表明LLZ1纖維素酶受[EMIM]DEP的抑制具有底物依賴性。隨后動力學參數(shù)分析顯示Km顯著升高，表明[EMIM]DEP降低了酶與底物的親和度。而Vmax變化較小，進一步深入研究證明LLZ1纖維素酶在更高底物

5、濃度時受到的抑制更小。接著SDS-PAGE酶譜分析顯示在低于30.0％的[EMIM]DEP中內(nèi)切β-葡聚糖酶表現(xiàn)為可逆失活;在高于40.0％[EMIM]DEP中開始出現(xiàn)不可逆失活。LLZ1產(chǎn)生的不同內(nèi)切β-葡聚糖酶對[EMIM]DEP耐受能力有所差異。最后，添加金屬離子和表面活性劑有助于改善[EMIM]DEP溶液中的酶活力，0.7mM的Ca2+和0.5‰的Tween80分別使酶活力提高31.2％、48.4％。
　　本文的研究為生物