KRN4順式調(diào)控UB3影響玉米穗行數(shù)的分子機(jī)理.pdf

1、禾本科單子葉植物水稻和玉米，分支均包括葉腋分生組織(axillary meristems:AMs)產(chǎn)生的分蘗和花序分支分生組織(branch meristems:BMs)產(chǎn)生的花序分支。研究表明，參與調(diào)控分蘗和穗分支的基因，在水稻和玉米中具有一定的同源性。unbranched3(UB3)屬于SBP-box轉(zhuǎn)錄因子家族的基因，通過調(diào)控腋芽原基的起始來影響雄穗分支和雌穗穗行數(shù)的變異，進(jìn)而影響產(chǎn)量，但是其作用機(jī)理并不清楚。KRN4是一個(gè)穗行數(shù)

2、主效位點(diǎn)，為UB3下游～60kb處的基因間區(qū)域，UB3的表達(dá)與功能位點(diǎn)KRN4的基因型顯著關(guān)聯(lián)，但是KRN4遠(yuǎn)距離調(diào)控UB3的作用方式還有待解析。本研究將UB3在玉米和水稻中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，解析了UB3在水稻和玉米中影響穗分支發(fā)育的功能，為禾本科植物基部的分蘗和花序分支系統(tǒng)的建立提供基礎(chǔ)。此外，還研究了KRN4遠(yuǎn)距離調(diào)控UB3表達(dá)的作用方式，建立了假說，為非編碼基因間區(qū)調(diào)控基因表達(dá)提供了依據(jù)。主要結(jié)果如下
　　1.UB3過量表達(dá)抑制

3、玉米愈傷的分化和水稻分支的發(fā)育:將UB3在玉米進(jìn)行過表達(dá)，顯著抑制愈傷的分化和再生，不能形成幼苗;將UB3在水稻中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，UB3過表達(dá)時(shí)，顯著抑制株高、分蘗和穗分支;UB3適度表達(dá)時(shí)，輕微的減少分蘗和株高，并增加穗分支和穗粒數(shù)。
　　2.UB3通過細(xì)胞分裂素水平調(diào)控水稻分支發(fā)育:對(duì)UB3過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系的莖尖分生組織和幼穗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)合已有的Ideal Plant Architecture1(IPA1)Chroma

4、tin Immunoprecipitation quantitative PCR(ChIP-seq)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并結(jié)合體外驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)UB3蛋白可以結(jié)合在LONELY GUY1（LOG1），LOC_OS04G44354和OsCKX2基因的啟動(dòng)子區(qū)域，在UB3過量表達(dá)材料中，降低細(xì)胞分裂素的合成并促進(jìn)其降解，使得分生組織細(xì)胞分裂素水平降低。對(duì)水稻苗期地上部分進(jìn)行細(xì)胞分裂素水平的測(cè)量，發(fā)現(xiàn)UB3過表達(dá)植株中細(xì)胞分裂素含量確實(shí)有所降低，符合

5、預(yù)期。因此UB3通過影響分生組織中細(xì)胞分裂素的水平，影響細(xì)胞分裂的速率，從而參與腋生分生組織分支發(fā)育的調(diào)控。而UB3適量表達(dá)時(shí)，可以通過與SPL(SPL7，SPL14，SPL17)基因合作，精準(zhǔn)調(diào)控小穗的發(fā)育。
　　3.UB3可能通過細(xì)胞分裂素途徑和CLAVATA-WUSCHEL途徑調(diào)控玉米穗行數(shù)發(fā)育:對(duì)ub3::mum和野生型株系的幼穗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在所有的與細(xì)胞分裂素相關(guān)的差異表達(dá)基因中，17個(gè)與之合成相關(guān)的基因在突變體

6、中上調(diào)表達(dá)，3個(gè)與之降解途徑相關(guān)的基因下調(diào)表達(dá)。因此認(rèn)為細(xì)胞分裂素途徑在UB3調(diào)控玉米穗行數(shù)發(fā)育過程中也存在。此外，影響玉米分生組織發(fā)育的CLAVATA-WUSCHEL負(fù)反饋調(diào)控途徑上的一些基因，包括THICK TASSEL DWARF1(td1)，F(xiàn)ASCIATED EAR2(fea2),COMPACT PLANT2(ct2)和FASCIATED EAR3(fea3),FON2-LIKE CLE PROTEIN1(ZmFCP1),WU

7、SCHEL1(ZmWUS1)和CLA VATA3(ZmCLV3)均檢測(cè)到有差異表達(dá)，結(jié)合體外的實(shí)驗(yàn)，證明了UB3蛋白可以直接結(jié)合在ZmFCP1，ZmWUS1的啟動(dòng)子區(qū)域，直接調(diào)控它們的表達(dá)。
　　4.KRN4順式增強(qiáng)UB3的表達(dá):KRN4是一個(gè)基因間區(qū)域，在負(fù)調(diào)控穗行數(shù)的功能基因UB3下游～60Kb處。在krn4-mum12-3mm的雌穗中，UB3的表達(dá)量相對(duì)于野生型顯著下降，成熟時(shí)期雌穗的穗行數(shù)、雄穗的一級(jí)分支數(shù)、二級(jí)分支數(shù)等均

8、顯著高于野生型。KRN4在不同的玉米自交系中存在兩種不同的單倍型，即KRN4NX和KRN4，KRN4NX較KRN4存在1.2kb的插入。瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果表明，不同單倍型的KRN4均能增強(qiáng)報(bào)告基因的表達(dá)，并且KRN4的增強(qiáng)效應(yīng)要強(qiáng)于KRN4NX，KRN4也可以直接作用于pUB3，產(chǎn)生相同趨勢(shì)的變化差異。
　　5.KRN4的結(jié)合蛋白分析:通過酵母單雜、凝膠阻滯遷移和瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了玉米OCS Element Binding Fact

9、orsl(OBFl)和OCS Element Binding Factors4(OBF4)可以結(jié)合在KRN4的E1增強(qiáng)子元件，并增強(qiáng)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)。
　　6.UB2正調(diào)控UB3表達(dá):UB2是UB3的旁系同源基因，UB2和UB3的雙突變體能加強(qiáng)ub2或ub3單突變體穗部的表型。在UB2過表達(dá)植株和突變體ub2::mum的幼穗中，發(fā)現(xiàn)UB2正調(diào)控UB3表達(dá)。通過UB2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系幼穗的ChIP-qPCR，發(fā)現(xiàn)UB2結(jié)合在K

10、RN4-P4位點(diǎn)以及UB3-P位點(diǎn)。并且雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明UB2，OBF1和OBF4兩兩之間存在互作。
　　7.總結(jié)KRN4順式調(diào)控UB3影響玉米穗行數(shù)的途徑:UB2蛋白介導(dǎo)KRN4和UB3transcription start site(TSS)之間染色質(zhì)環(huán)的形成，使得KRN4在空間上靠近UB3的啟動(dòng)子區(qū)域;KRN4招募OBF1和OBF4蛋白，與UB2蛋白形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體作用于UB3的啟動(dòng)子區(qū)域，在RNA polymerase