真菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化廢棄秸稈生產(chǎn)微生物油脂技術(shù)的研究.pdf

1、微生物油脂，又稱單細胞油脂，由產(chǎn)油微生物產(chǎn)生，在組成成分上類似植物油。美國國家可再生能源實驗室(NREL)的報告曾特別指出，微生物油脂發(fā)酵可能是生物柴油產(chǎn)業(yè)和生物經(jīng)濟的重要研究方向。而能否采用廉價的原料和合適的生產(chǎn)方式來降低成本是微生物油脂生產(chǎn)能否規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵點之一。本文對廢棄秸稈發(fā)酵轉(zhuǎn)化微生物油脂的兩種技術(shù)策略進行了研究。其中在秸稈-微生物油脂轉(zhuǎn)化的多菌種分步發(fā)酵研究中，側(cè)重于小麥秸稈糖轉(zhuǎn)化率提高的關(guān)鍵技術(shù)研究，選擇以“設(shè)計具

2、有高效秸稈糖化能力的酶系生產(chǎn)混菌體系”為研究方向。此后，考慮到多菌種分步發(fā)酵過程繁瑣，多菌種發(fā)酵控制復雜等問題，提出了一步法發(fā)酵轉(zhuǎn)化(CBP)纖維素生產(chǎn)微生物油脂的策略。在獲得多株能直接轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素材料為微生物油脂的菌種的基礎(chǔ)上，建立了CBP微生物油脂發(fā)酵體系。隨后，以AspergillusoryzaeA-4和Penicilliumsp.P-2為主要研究對象，進行了發(fā)酵優(yōu)化、CBP行為分析和遺傳改造等研究。論文的主要研究結(jié)果如下:

3、r>　　 (1)具有高效秸稈糖化能力的酶系生產(chǎn)混菌體系的設(shè)計及特性研究:采用正交試驗和統(tǒng)計分析輔助進行高效混菌體系的人工設(shè)計，獲得了一組高效的纖維素酶生產(chǎn)菌系Consortium-APcT2。Consortium-APcT2由Trichodermasp.T-1、P.chrysosporium和A.oryzaeA-4構(gòu)成，其比例為92∶6.7∶1.3。Consortium-APcT24天發(fā)酵后獲得的酶系能在20小時內(nèi)，將1g堿預處理秸稈

4、轉(zhuǎn)化為805.12mg的可發(fā)酵糖，對粗纖維的轉(zhuǎn)化率為85％左右。與單菌中產(chǎn)酶效果最好的Trichodermasp.T-1相比，轉(zhuǎn)化率提高了26.98％。混菌組合Consortium-APcT2的性質(zhì)研究結(jié)果表明，Consortium-APcT2具有高效秸稈糖化能力的酶系生產(chǎn)能力的原因有:1）A.oryzaeA-4，P.chrysosporium和Trichodermasp.T-1的相互作用增加了胞外木質(zhì)纖維素降解相關(guān)酶系的分泌，特別是β

5、-葡萄糖苷酶和木聚糖酶;2）不同菌種分泌的纖維素酶酶系在水解過程具有協(xié)同作用。最后，以Consortium-APcT2為發(fā)酵菌劑設(shè)計纖維素酶生產(chǎn)和秸稈水解連續(xù)反應(yīng)制備可發(fā)酵性糖液用于T.fermentans發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂，油脂產(chǎn)量可達2.3g(1)-1。而在相同發(fā)酵條件下，以小麥秸稈硫酸水解液為底物獲得的油脂產(chǎn)量僅為1.7g(1)-1。
　　 (2)纖維素-微生物油脂轉(zhuǎn)化(CBP)的單菌株一步發(fā)酵菌種的篩選:采取從纖維素降解

6、菌中篩選和從植物內(nèi)生真菌中篩選兩種不同策略分離可以一步法轉(zhuǎn)化纖維素類底物高產(chǎn)三酰甘油酯的發(fā)酵菌種。纖維素降解菌米曲霉(A-4)、青霉(P-2)和木霉(KmG-1)的油脂積累能力較強，胞內(nèi)油脂含量分別為21.50％，17.50％和11.22％。從油料作物木油桐及西川樸中篩選得到具有纖維素降解和油脂高積累能力的內(nèi)生真菌Fusariumoxysporum，F(xiàn)usariumsolani,Fungalendophytesp.和Mucorsp.，其

7、中Fusariumoxysporum胞內(nèi)油脂含量為26.60％，F(xiàn)usariumsolani為29.75％。
　　 (3)PenicilliumP-2纖維素油脂轉(zhuǎn)化及液態(tài)CBP發(fā)酵行為研究:綜合各菌株的胞內(nèi)油脂積累和固體秸稈培養(yǎng)基中的生長能力，選擇PenicilliumP-2進行后續(xù)發(fā)酵研究。液態(tài)發(fā)酵纖維素粉和固態(tài)發(fā)酵秸稈麩皮混合物的實驗結(jié)果表明PenicilliumP-2可以用于秸稈的微生物油脂轉(zhuǎn)化，其在液體發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵條件

8、下可達到的最高油脂產(chǎn)量分別為0.65g/l和40.13mg/gds。PenicilliumP-2固態(tài)發(fā)酵秸稈麩皮混合物生產(chǎn)微生物油脂的最優(yōu)條件為:起始料水比4∶2，pH6，發(fā)酵溫度30℃，Tween-800.2％。對液態(tài)發(fā)酵后所得到的油脂產(chǎn)量和纖維素酶酶活力的相關(guān)分析結(jié)果表明P-2的纖維素酶分泌能力會影響油脂生產(chǎn)。外源纖維素酶添加實驗證實提高培養(yǎng)基中纖維素酶活力以增強可發(fā)酵糖類的含量可以提高P-2的油脂積累和生長。添加24FPU/gds

9、的纖維素酶使得P-2發(fā)酵后的最高油脂產(chǎn)量達到0.83g/l。
　　 (4)AspergillusoryzaeA-4固態(tài)發(fā)酵秸稈麩皮混合物的微生物油脂生產(chǎn)及發(fā)酵優(yōu)化:盡管PenicilliumP-2的纖維素降解能力和油脂積累能力都很強，但是其利用秸稈發(fā)酵獲得的微生物油脂產(chǎn)量并不可觀。因此，對另一株在固體秸稈培養(yǎng)基中生長最旺的菌株A.oryzaeA-4進行研究。以纖維素為唯一碳源進行液態(tài)發(fā)酵，A-4可在胞內(nèi)積累15％-18.15％的

10、油脂。隨后，以固態(tài)發(fā)酵秸稈麩皮混合物為主要研究方式，開展了CBP行為研究和發(fā)酵優(yōu)化，推測了菌株A-4轉(zhuǎn)化固體秸稈積累油脂的大致過程。研究結(jié)果表明，A-4在不添加纖維素酶的條件下，固態(tài)發(fā)酵秸稈麩皮混合物最高可生產(chǎn)單細胞油脂(SCOs)62.87mg/gramdrysubstrate(gds);纖維素酶可影響A-4的油脂產(chǎn)量;共發(fā)酵秸稈與其他工農(nóng)業(yè)廢棄物也可以提高A-4的油脂生產(chǎn)。
　　 (5)纖維素酶基因在A.oryzaeA-4中

11、的插入表達及高效產(chǎn)油重組菌的篩選:基于纖維素酶對CBP油脂生產(chǎn)的影響，對油脂生產(chǎn)較強的A-4進行基因工程改造。
　　 采用重疊PCR和同源重組技術(shù)，以A.oryzaeRIB40的hlyA啟動子、淀粉酶表達框的終止子和帶PT抗性基因的質(zhì)粒pPTRI為元件，構(gòu)建了能夠在產(chǎn)油A.oryzaeA-4中表達外源基因的重組載體pPTRI-Tamy-gene。在經(jīng)過eGFP蛋白驗證了所構(gòu)建的遺傳表達系統(tǒng)的可行性后，以來源于A.oryzaeRI

12、B40基因組的4種纖維素酶基因celA，celB，celD，celC為目的片段，構(gòu)建了纖維素酶表達A-4載體。成功轉(zhuǎn)化A.oryzaeA-4后，通過PCR驗證和液態(tài)發(fā)酵秸稈實驗篩選獲得5個纖維素酶活力大大提高的陽性轉(zhuǎn)化子。其中A2-2和D1-B1在液體發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵條件下可產(chǎn)生大大高于WT的油脂產(chǎn)量。在無優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵條件下，轉(zhuǎn)化子D1-B1在發(fā)酵4天即可達到最大油脂產(chǎn)量63.30mg/gds。發(fā)酵特性對比實驗表明外源基因插入表達抑制了