青蒿二烯功能模塊與酵母底盤(pán)的適配性研究.pdf

1、作為抗瘧疾藥物青蒿素的關(guān)鍵前體,青蒿二烯的異源合成近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。盡管青蒿二烯的異源合成已經(jīng)達(dá)到了較高水平,構(gòu)建功能釀酒酵母細(xì)胞合成青蒿二烯的關(guān)鍵是使外源功能模塊和底盤(pán)細(xì)胞適配,外源模塊與底盤(pán)細(xì)胞適配性的提高可以為產(chǎn)量的進(jìn)一步提高提供可能。
　　本研究首先使用著絲粒載體和附加型載體構(gòu)建兩種青蒿二烯功能模塊,在過(guò)表達(dá)甲羥戊酸途徑中關(guān)鍵基因(截短的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因tHMGR、法尼基焦磷酸合酶基因ERG20)

2、的兩種酵母底盤(pán)中進(jìn)行適配,得到適配性較好的功能酵母細(xì)胞,其產(chǎn)量為11.2mg/L,選用適配性最好的附加型載體與改造的W303a底盤(pán)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究,進(jìn)一步提高外源模塊與底盤(pán)間的適配性。
　　隨后將青蒿二烯合酶基因ADS與ERG20進(jìn)行融合構(gòu)建融合蛋白功能模塊,并采用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子(TDH1p、TDH3p、TEF1p、PGK1p)對(duì)融合蛋白功能模塊進(jìn)行調(diào)控,其中PGK1p所調(diào)控的融合蛋白(ERG20-ADS)功能模塊與底盤(pán)間的適配

3、性最好,產(chǎn)量相較第一部分提高了5.4倍,達(dá)到71.8mg/L。
　　最后,以20種基于BY4742的基因缺失酵母為底盤(pán)細(xì)胞,探究這些基因的敲除對(duì)于青蒿二烯合成的影響。結(jié)果表明,與野生型酵母BY4742相比,16種基因缺失酵母中青蒿二烯的產(chǎn)量體現(xiàn)出不同程度的提高或降低,證明這些基因的敲除對(duì)青蒿二烯的合成存在間接的作用。
　　本研究通過(guò)對(duì)外源模塊的載體類(lèi)型、啟動(dòng)子強(qiáng)度、表達(dá)方式進(jìn)行優(yōu)化及與不同遺傳背景的酵母底盤(pán)間的適配性研究,逐