紫杉二烯生物合成模塊的構(gòu)建與模塊-底盤間的適配性研究.pdf

1、天然化合物的生物合成是合成生物學(xué)的主要研究內(nèi)容之一。萜類化合物是天然化合物的重要組成部分,在醫(yī)藥、能源領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用及發(fā)展前景。本文在合成生物學(xué)指導(dǎo)思想之下,利用釀酒酵母作為底盤細胞,構(gòu)建二萜化合物紫杉二烯的人工合成細胞。
　　紫杉二烯是一類二萜化合物衍生物。四分子異戊二烯基焦磷酸(IPP,5C)在相關(guān)酶的催化下先后生成牻牛兒基焦磷酸(GPP,10C)、法尼基焦磷酸(FPP,15C)、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP,20C

2、),再經(jīng)紫杉二烯合成酶環(huán)化生成紫杉二烯。本文克隆了N端截短的羥甲基戊二酰CoA基因(tHMGR)、轉(zhuǎn)錄因子UPC2編碼基因的點突變等位基因UPC2.1,構(gòu)建了鯊烯合成酶基因ERG9的下調(diào)元件,對釀酒酵母中負責(zé)IPP合成的甲羥戊酸(MVA)途徑進行了優(yōu)化,又引入人工合成的外源基因:紫杉二烯合成酶基因TS(短葉紅豆杉來源),GGPP合成酶基因GGPPSsa(嗜酸熱硫化葉菌來源)及GGPP合成酶基因CarG(三胞不拉氏霉菌來源),在酵母底盤內(nèi)

3、,人工構(gòu)建了紫杉二烯生物合成模塊,實現(xiàn)了紫杉二烯在釀酒酵母底盤中的生物合成。隨后,本文利用酵母組裝技術(shù),對紫杉二烯生物合成途徑中的必要基因進行重新設(shè)計組裝,構(gòu)建了依托單一CEN質(zhì)粒的紫杉二烯生物合成模塊。
　　本文將實驗所構(gòu)建的多種紫杉二烯生物合成模塊與不同的酵母底盤細胞進行適配,構(gòu)建了多種紫杉二烯人工合成細胞,并對比了各個菌株在選擇型合成培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)紫杉二烯的產(chǎn)量。本文使用的酵母底盤有W303、YSG50、BY4742及BY

4、4742的單敲菌株YPL062W、YIL074C、YLR085C、YNL280C及YDR215C。實驗結(jié)果顯示酵母組裝技術(shù)構(gòu)建的單質(zhì)粒紫杉二烯生物合成模塊在各底盤細胞中均擁有較高紫杉二烯產(chǎn)量,并且在底盤YPL062W、YIL074C、YNL280C及YDR215C中的產(chǎn)量高于其他底盤,最高產(chǎn)量達到13.52mg/L。
　　最后本文又選擇了所構(gòu)建的部分紫杉二烯人工合成細胞,使用YPD培養(yǎng)基進行發(fā)酵實驗,實驗結(jié)果中,包含單一CEN質(zhì)粒