阿特拉津量熱傳感快速檢測技術(shù)研究.pdf

1、本項目以食品生產(chǎn)過程中典型農(nóng)藥污染物阿特拉津(ATZ)為靶標，針對現(xiàn)有生物檢測方法因?qū)悠饭鈱W性質(zhì)要求高導致的樣品前處理復雜與檢測信號需要多次放大導致的檢測步驟繁瑣及儀器法中檢測設(shè)備昂貴等不足對快速檢測技術(shù)的發(fā)展的制約，通過建立新型量熱檢測技術(shù)平臺加以克服。闡明熱信號轉(zhuǎn)換與調(diào)控機制，優(yōu)化流動注射控制、熱信號采集與再生等系統(tǒng)，實現(xiàn)食品中農(nóng)藥殘留的樣品前處理簡便、特異快速定量分析，為量熱傳感技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)、提供技術(shù)支持

2、。
　　本研究室成功構(gòu)建了針對典型三嗪類農(nóng)藥殘留ATZ的量熱檢測方法體系。
　　1、基于固定化單克隆抗體的直接競爭量熱檢測技術(shù)
　　首先對ATZ進行羧基化修飾并采用碳二亞胺法與β-內(nèi)酰胺酶偶聯(lián)得到酶標記的ATZ(ATZ-β)。另一方面，將純化得到的ATZ單克隆抗體(mAb)通過戊二醛法固定于固相載體-可控有孔玻璃球(CPG)上，并將其作為量熱調(diào)節(jié)器（恒溫裝置）中反應(yīng)柱填料，作為識別元件。
　　本方法選用β-內(nèi)酰胺

3、酶及青霉素G鈉為酶-底物對子進行量熱檢測方法的建立。制備的ATZ-β，經(jīng)MALDI-TOF/MS鑒定，摩爾偶聯(lián)比為ATZ∶β-內(nèi)酰胺酶為2∶1。經(jīng)辛酸-硫酸銨鹽析法對ATZ腹水型單克隆抗體進行純化。經(jīng)BCA蛋白定量法測定，純化后蛋白含量為2.8 mg mL-1。檢測條件優(yōu)化結(jié)果為:ATZ-β0.25 mg mL-1（稀釋比為1∶10）、底物選用青霉素G鈉濃度，最佳使用濃度為16 mmol L-1。量熱體系流動相流速優(yōu)化為800μl mi

4、n-1。再生液組分優(yōu)化為0.1mol L-1 pH2.3的Gly-HCl并含有1％ DMSO、0.1％ TritonⅩ-100(v/v)，再生時間為10min。建立的直接競爭檢測方法，線性檢測范圍為0.7-3.9μg mL-1，檢出限為0.4μg mL-1。信號穩(wěn)定性良好，相同樣品連續(xù)上樣6次，信號相對標準差在5％以內(nèi)。該檢測方法僅對三嗪類農(nóng)藥中西瑪津有明顯交叉反應(yīng)(36.4％)，認為主要是由于兩者結(jié)構(gòu)高度類似，后者僅比前者多一個甲基。

5、對于其它結(jié)構(gòu)類似物未檢測到交叉反應(yīng)性。對分別以玉米秸稈及雙蒸水為基質(zhì)的樣品量熱信號比較發(fā)現(xiàn)，量熱檢測方法受基質(zhì)效應(yīng)影響不明顯。以新鮮玉米秸稈及玉米秸稈青儲為實樣進行加標回收實驗。樣品僅需過濾與調(diào)整pH后即可進樣。加標回收實驗回收率在88％-107％之間，與高效液相色譜法(HPLC)檢測結(jié)果具有良好的一致性。該量熱檢測方法信號響應(yīng)穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，樣品前處理簡便。從加入待測樣品到加入酶特異性底物產(chǎn)生完整量熱信號需要時間約12 min。將進樣

6、前本底信號的測定、產(chǎn)生量熱信號后的再生步驟及流動相轉(zhuǎn)換為載液后基線的恢復所消耗的總時間計算在內(nèi)，一個樣品的檢測總時間約為45 min。固定化抗體柱可穩(wěn)定檢測約130-150樣品。使用完畢，反應(yīng)柱于4℃保存于載液內(nèi)或20％乙醇溶液內(nèi)。
　　建立的量熱檢測方法樣品前處理簡單，信號響應(yīng)直觀快速，實現(xiàn)了對玉米秸稈樣品的加標檢測，檢測靈敏度滿足相關(guān)最大殘留量限量標準。本方法的建立，克服了傳統(tǒng)檢測方法的不足，實現(xiàn)了針對典型三嗪類除草劑ATZ的

7、特異性、快速量熱檢測方法的建立。固定化抗體柱穩(wěn)定性好，可滿足現(xiàn)場、快速農(nóng)藥殘留檢測的要求，可以作為農(nóng)藥殘留現(xiàn)場快篩查手段之一，在實際工作中推廣應(yīng)用。
　　2、基于ProteinG瓊脂糖凝膠的通用性量熱傳感技術(shù)研究
　　在建立方法一的基礎(chǔ)上，通過引入離線孵育步驟與使用通用性識別元件構(gòu)建高靈敏、通用性量熱生物檢測技術(shù)。含有ATZ的待測樣品中加入一定量ATZ-β與mAb?；诟偁幏ㄔ?，在離線孵育條件下：37℃水浴，樣品混合液中A

8、TZ與ATZ-β競爭結(jié)合mAb上的特異識別位點，形成抗ATZ-mAb和ATZ-β-mAb復合物。
　　本方法在重新計算投料量及投料比的基礎(chǔ)上，重新制備了ATZ-β。將MALDI-TOF/MS鑒定，摩爾偶聯(lián)比達到ATZ∶β-內(nèi)酰胺酶為11∶1。離線孵育條件為37℃30 min。樣品混合液中另需加入0.5％甘油，以增加蛋白表面水膜穩(wěn)定性，減少因其所致的非特異性吸附，進而增加信號響應(yīng)特異性。對酶特異性底物進行了篩選并對其使用濃度進行了優(yōu)

9、化，最終確定為Amp4 mmol L-1。量熱檢測體系流速優(yōu)化為400μl min-1。新制備的ATZ-β濃度為0.8gL-1，優(yōu)化后最佳使用稀釋比為1∶100。ATZ-mAb與方法一中一致，濃度為2.8 mg mL-1，但是其最佳使用稀釋比優(yōu)化為1∶8000。再生液組分優(yōu)化為0.1mol L-1 pH2.3的Gly-HCl溶液并含有1％ DMSO、0.1％ TritonⅩ-100(v/v)及500 mmol L-1 NaCl。

10、　　本方法的建立實現(xiàn)了量熱檢測高靈敏度與強通用性的結(jié)合。離線孵育與流動相分離更利于二者反應(yīng)條件的分別優(yōu)化。在優(yōu)化后的37℃、30min水浴并含有0.5％甘油的離線孵育環(huán)境中，ATZ與ATZ-β實現(xiàn)對mAb結(jié)合位點的充分競爭結(jié)合。以對mAb上Fc區(qū)域有特異識別能力的PGSFF柱為流動相下識別元件，可以實現(xiàn)在不更換反應(yīng)柱的條件下對具有相應(yīng)抗體與酶標待測物的任意待測物進行檢測。PGSFF柱可重復使用次數(shù)不如固定化抗體柱的使用次數(shù)，但也足以滿足

11、實際檢測中對反應(yīng)柱連續(xù)檢測性能的需要。本方法成功實現(xiàn)對自來水加標樣品的檢測。與方法一相比，在樣品前處理簡便的前提下極大的提高了ATZ檢測靈敏度及可檢測目標物范圍，為量熱傳感快速檢測技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用提供了進一步的理論與技術(shù)支持。
　　3、基于雙功能表面分子印跡聚合物的量熱仿生傳感技術(shù)研究
　　針對傳統(tǒng)免疫檢測中作為識別元件的生物抗體制備周期長、干擾因素多及檢測方法中用以促進溶解的有機溶劑易對抗體活性造成損傷的不足，將模

12、擬抗體——微米級表面分子印跡聚合物(S-MIP)作為識別元件及產(chǎn)熱元件與量熱技術(shù)相結(jié)合建立量熱仿生傳感技術(shù)。
　　通過對比分析，本方法選定以SSS為功能單體，在氨基化CPG表面通過表面同步接枝印跡聚合技術(shù)制備S-MIP。印跡體系溶劑選用DMF∶水=9∶1(v/v)，其中水相為pH3.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液。
　　與生物識別元件相比，本方法篩選并應(yīng)用的既可以作為識別元件也可以作為產(chǎn)熱元件的S-MIP，具備制備方法簡便、制備周期

13、短，不同批次識別元件的一致性容易控制的優(yōu)勢。該方法的建立實現(xiàn)了農(nóng)藥殘留的無標記、快速量熱檢測，通量較前兩種方法明顯高。本方法中反應(yīng)柱可重復使用百次以上而無需頻繁再生，非常利于大規(guī)模樣品的現(xiàn)場快速篩查。但其特異性不足需要進一步通過優(yōu)化印跡配方，制備新型印跡材料加以克服。
　　4、基于直接競爭的農(nóng)藥殘留高靈敏量熱仿生傳感技術(shù)研究
　　在已有量熱仿生傳感技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化印跡配方及引入競爭法建立高靈敏量熱仿生檢測方法。印跡體系

14、溶劑選用DMF∶水=9∶1(v/v)，其中水相為pH5.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液。印跡材料投料量為:模版分子ATZ2.85 g，功能單體MAA5.635 mL，交聯(lián)劑BIS1.46 g，引發(fā)劑APS0.136g;投料摩爾比為MAA∶ ATZ=5∶1，MAA∶ BIS=7∶1，APS為MAA質(zhì)量的1.1％。等溫吸附實驗未觀測到明顯吸附。載液為0.02 mol L-1 pH5.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液，含有2％ DMF。體系溫度選定為37℃，流

15、速優(yōu)化為1000μL min-1。再生液為含有1mol L-1NaCl的50％(v/v)甲醇水溶液，再生時間為2min。與對苯乙烯磺酸鈉相比，以MAA為功能單體制備的印跡產(chǎn)物S-MIP可以產(chǎn)生明顯競爭抑制信號。在實驗條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上建立了高靈敏量熱仿生技術(shù)。0.8 mg mL-1 ATZ-β使用稀釋比優(yōu)化為1∶400，酶特異性底物Amp濃度為4 mmol L-1。該方法線性檢測范圍為0.6-4.1ng mL-1，檢出限為0.4 ng m

16、L-1。信號穩(wěn)定性良好，相同樣品連續(xù)上樣6次，信號相對標準差在2％以內(nèi)。該方法具有很好特異性，與結(jié)構(gòu)類似物西瑪津交叉反應(yīng)率僅為5.7％，與三聚氰胺交叉反應(yīng)率為3.7％。以自來水為目標物進行加標回收實驗，回收率在89.8％-95.3％之間，檢測結(jié)果與高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)具有較好的可比性。S-MIP可穩(wěn)定連續(xù)檢測30-50次。從進樣到加入底物產(chǎn)生完整量熱響應(yīng)信號需約9 min。將進樣前本底信號測量、進樣并測定量

17、熱信號后的再生及流動相恢復為載液后恢復穩(wěn)定基線的時間計算在內(nèi)，一個樣品的完整檢測時間為約30 min。雖然連續(xù)檢測樣品之間需要再生，但是在檢測靈敏度上較前一個建立的量熱仿生方法有3個數(shù)量級的提高。S-MIP識別特異性優(yōu)于ATZ的mAb，說明合成的識別元件其識別能力可以優(yōu)于單克隆抗體，為進一步優(yōu)化印跡配方提供了理論支撐。在量熱信號上，隨著ATZ濃度增加，一定范圍內(nèi)信號響應(yīng)線性良好，實現(xiàn)了高靈敏量熱仿生技術(shù)的建立。
　　該方法實現(xiàn)了量