基于TUDCA生物轉化的固定化酶填充床反應器流場模擬及實驗研究.pdf

1、目前?；切苋パ跄懰幔═auroursodeoxycholic acid, TUDCA）主要利用人工提取熊膽汁的方式來獲得，但由于熊膽資源的稀缺性和來源的特殊性使 TUDCA的產量遠遠不能滿足臨床用藥需求。本文在本課題組提出的雙酶偶聯(lián)固定化酶促反應生產 TUDCA方法的基礎上，著眼于高效固定化酶生物反應器的開發(fā)，應用FLUENT軟件模擬分析了填充床反應器內的流場，探討了流速和反應器高徑比對反應器流場分布的影響，并進一步通過實驗對模擬的結果

2、進行驗證和分析，獲得了能在一定程度上代替實驗過程的CFD模型。研究將為進一步反應器的設計提供理論和實驗依據。
　　本課題來源于項目編號為2014ZX09301306-007的國家科技重大專項新藥創(chuàng)制項目，主要研究內容及結果如下：
　　①應用 pGEX-6p-1和 GST融合基因表達系統(tǒng)對7α-羥基類固醇脫氫酶(7α-HSDH)和7β-羥基類固醇脫氫酶(7β-HSDH)進行了表達和純化，并以殼聚糖為載體對7α-HSDH和7β-

3、HSDH進行了固定。1)通過 GST一步親和純化獲得了7α-HSDH和7β-HSDH游離酶，電泳分析為具有唯一清晰且較寬的條帶，酶的濃度分別為1.776mg/mL和2.059mg/mL，酶比活分別為24.16U/mg和49.36U/mg。2)應用戊二醛活化的殼聚糖微球對7α-HSDH和7β-HSDH進行固定化，結果表明兩種酶的固定率均大于98％。
　?、诶秒p酶偶聯(lián)共固定對TUDCA進行生物轉化，優(yōu)化獲得了該雙酶偶聯(lián)共固定系統(tǒng)的適

4、宜pH值、溫度和底物濃度，為進一步的實驗研究確定了酶促反應的最佳參數(shù)。結果發(fā)現(xiàn)：1)pH值在7到11范圍內變化，固定化酶對TUDCA轉化效率為pH9＞Ph11＞Ph10＞pH8＞pH7，因此最適pH值為9。2)當溫度從5℃到60℃變化時，固定化酶催化效率先緩慢升高，然后急劇降低，固定化酶對 TUDCA轉化效率為25℃＞15℃＞5℃＞37℃＞45℃＞60℃，因此最適溫度為25℃。3)當?shù)孜餄舛葟?mM到25mM變化時，固定化酶催化能力先增

5、強，后減弱，固定化酶對TUDCA轉化效率為10mM＞15mM＞20mM＞25Mm＞5Mm，因此最適底物濃度為10mM。
　?、蹜肍LUENT6.3軟件對填充床反應器的流場進行了模擬分析，研究了循環(huán)流速和反應器高徑比對流場的影響。我們發(fā)現(xiàn)：1)當反應器高徑比一定時，流場的均勻性隨著流速的增大而增大，這將使底物與酶的接觸越充分，越有利于酶促反應的進行。2)在一定流速下，改變高徑比，高徑比越大，液體流過的相對橫截面積相同，但是液體在反

6、應器中的滯留時間越長，致使底物與酶接觸時間越長，越有利于酶促反應的進行。
　　④采用固定化酶填充床反應器研究驗證了循環(huán)流速和反應器高徑比對TUDCA生物轉化的影響。1)在高徑比為30:16，循環(huán)流速分別為1mL/min,2mL/min,4mL/min的反應器中，通過比較體積生產效率，結果表現(xiàn)為4mL/min＞2mL/min＞1mL/min，與模擬實驗結果相符。2)在流速為2mL/min，高徑比分別為30:16,60:16,100: