基于納米材料和核酸適配體的高靈敏度光學生物傳感器研究.pdf

1、近年來，生物傳感器因具有靈敏度高、選擇性好、成本低和方便快捷等優(yōu)點，被廣泛地應用到與生命活動相關的核酸分子、蛋白質(zhì)、金屬離子、小分子和酶的檢測當中。納米材料和功能核酸的發(fā)展，為構建新穎的、用于各種目標物檢測的生物傳感技術提供了全新的設計思路和平臺。
　　本論文作為國家自然科學基金(No.21173071)和教育部高等學校博士點專項基金資助課題(No.20114104110002)的一部分，通過把功能核酸和納米材料相結(jié)合，構建了幾種

2、光學生物傳感器用于對重金屬離子、生物小分子和酶活性及其抑制劑的檢測。與傳統(tǒng)檢測方法相比，本論文所建立的傳感器對目標物的檢測具有靈敏度高、選擇性好、成本低和操作簡單等優(yōu)點，同時初步驗證了傳感器的實用性。其主要內(nèi)容如下:
　　在第二章中構建了一種基于水溶性聚噻吩衍生物和非標記功能核酸的光學傳感器，可以簡單快速、高靈敏地和高選擇性地檢測水溶液中的鉛離子。該傳感器檢測原理是利用鉛離子誘導富含G堿基的核酸DNA的結(jié)構從自由卷曲狀態(tài)到G-四鏈

3、體狀態(tài)，同時使用陽離子水溶性聚噻吩(PMNT)作為信號產(chǎn)生單元來產(chǎn)生光學信號。通過使用特定的核酸序列TBAA（5'-GGAAGGTGTGGAAGG-3'），實現(xiàn)了對鉛離子的特異性識別，避免了傳統(tǒng)功能核酸傳感器使用掩蔽劑(CN-，SCN-)用于消除汞離子的干擾所帶來的問題。當溶液中不存在鉛離子時，PMNT與DNA探針通過靜電相互作用，形成類雙鏈的剛性復合物，使得PMNT骨架的共軛程度增大，溶液顯現(xiàn)紅色。當溶液中存在鉛離子時，鉛離子會誘導D

4、NA探針折疊成G-四鏈體結(jié)構，PMNT通過靜電作用纏繞在G-四鏈體表面形成復合物，在該復合物中PMNT的共軛程度低，溶液顏色為黃色?；谝陨显恚緜鞲衅鲗崿F(xiàn)了對鉛離子的高靈敏和特異性檢測。本傳感器可以在5分鐘內(nèi)快速的檢測水溶液中微摩爾濃度的鉛離子，利用熒光檢測方法可以把檢測限提高到納摩爾級別。該傳感器成功的被應用到自來水中鉛離子的檢測。
　　在第三章中基于氧化石墨烯對單鏈DNA和G-四鏈體DNA的吸附能力不同，設計了一種熒光增強

5、型的G-四鏈體傳感器用于鉛離子的檢測。通過使用在第二章中篩選出的核酸序列TBAA作為探針，實現(xiàn)了對鉛離子特異性的識別。首先在探針的5'末端修飾上熒光發(fā)色團，不存在鉛離子時，核酸探針在溶液中呈現(xiàn)柔軟的單鏈構象。加入氧化石墨烯，通過單鏈核酸的堿基與氧化石墨烯的芳香性六元環(huán)π-π堆積作用，單鏈核酸探針吸附在氧化石墨烯表面導致熒光發(fā)色團的熒光猝滅。當存在鉛離子時，鉛離子誘導TBAA從單鏈構象折疊成G-四鏈體構象。加入氧化石墨烯，因為G-四鏈體與

6、氧化石墨烯的作用力比較弱，帶有熒光發(fā)色團的G-四鏈體遠離氧化石墨烯的表面使熒光發(fā)色團的熒光不被猝滅。該傳感器對鉛離子的最低檢測限為400pM，同時該傳感器被成功的應用到河水和自來水中鉛離子的檢測。
　　在第四章中利用氧化石墨烯對單、雙鏈DNA的吸附能力不同，設計了一個基于氧化石墨烯的生物傳感器用于HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H的活性檢測及抑制劑篩選。首先在DNA序列的3'末端修飾上熒光發(fā)色團，然后與該序列互補的RNA雜交形成DN

7、A/RNA雜交體。不存在RNase H時，因為DNA/RNA與氧化石墨烯的相互作用比較弱，加入氧化石墨烯后DNA/RNA不能穩(wěn)定的吸附在氧化石墨烯的表面，因此熒光發(fā)色團的熒光不會被猝滅。當存在RNase H時，RNase H能夠催化DNA/RNA中的RNA裂解成核糖核苷片段從而釋放出單鏈DNA。加入氧化石墨烯后，單鏈DNA能夠強力的吸附在氧化石墨烯的表面導致熒光猝滅。當存在酶抑制劑時，RNaseH的酶活性被抑制，RNA/DNA依舊保持雙

8、鏈的狀態(tài)。加入氧化石墨烯后熒光不被猝滅。該傳感器對HIV-1 RNase H酶的最低檢測限為0.6units mL-1，同時可以進行高通量篩選HIV-1 RNase H酶抑制劑。本傳感器不僅提供了一個檢測HIV-1 RNase H酶活性和抑制劑篩選的通用平臺，也在抗艾滋病藥物的研發(fā)以及臨床治療方面表現(xiàn)出潛在的應用價值。
　　在第五章中發(fā)展了一種新型的基于核酸切刻酶輔助目標循環(huán)放大的分子適配體信標策略用于ATP高靈敏的檢測。切刻酶是

9、一種限制性核酸內(nèi)切酶，可特異性地識別雙鏈DNA中的核苷酸序列，并對其中的一條鏈進行切割。在本實驗中使用的切刻內(nèi)切酶是Nt.CviPII，能夠特異性的在5'-…↓CCA…-3'位點處切刻雙鏈DNA。在該傳感策略中，把ATP的核酸適配體分割成兩個短鏈寡聚核苷酸，Apt1和Apt2。其中Apt1的3'端修飾了熒光發(fā)色團。Apt1可以通過分子內(nèi)自組裝的方式形成分子信標。Apt1環(huán)狀部分可以和Apt2一同作為ATP的適配體。不存在ATP時，因為含

10、有錯配的堿基對，Apt2不能夠與Apt1中的環(huán)狀部位雜交。因為Apt1和Apt2含有大的單鏈結(jié)構，加入氧化石墨烯后，通過單鏈DNA的堿基與氧化石墨烯的芳香環(huán)結(jié)構之間的π-π堆積作用，Apt1和Apt2吸附在氧化石墨烯的表面導致Apt1的熒光猝滅。當存在ATP時，Apt2和ATP一起作用于Apt1的環(huán)狀部位打開Apt1的發(fā)卡結(jié)構形成雙鏈DNA。在這個雙鏈DNA結(jié)構中含有核酸切刻酶Nt.CviPII的切割位點。加入Nt.CviPII后，可以

11、把雙鏈DNA中的Apt1切割成兩部分，從而使APT和Apt2游離出來。游離出來的APT和Apt2又可以對另外一分子的Apt1分子信標進行互補配對，然后再次被酶切割，從而進行循環(huán)，累積許多含有熒光基團的短鏈DNA。因為被酶切割后Apt1是兩條短鏈DNA，其與氧化石墨烯的相互作用能力比較弱，從而遠離氧化石墨烯的表面產(chǎn)生熒光信號，并經(jīng)過多次循環(huán)后實現(xiàn)了信號放大效應。該方法實現(xiàn)了對ATP的高靈敏和高特異性檢測，響應動態(tài)范圍為10nM到1000n