基于納米材料和核酸適配體的高靈敏度光學(xué)生物傳感器研究.pdf

1、近年來，生物傳感器因具有靈敏度高、選擇性好、成本低和方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用到與生命活動(dòng)相關(guān)的核酸分子、蛋白質(zhì)、金屬離子、小分子和酶的檢測當(dāng)中。納米材料和功能核酸的發(fā)展，為構(gòu)建新穎的、用于各種目標(biāo)物檢測的生物傳感技術(shù)提供了全新的設(shè)計(jì)思路和平臺(tái)。
　　本論文作為國家自然科學(xué)基金(No.21173071)和教育部高等學(xué)校博士點(diǎn)專項(xiàng)基金資助課題(No.20114104110002)的一部分，通過把功能核酸和納米材料相結(jié)合，構(gòu)建了幾種

2、光學(xué)生物傳感器用于對重金屬離子、生物小分子和酶活性及其抑制劑的檢測。與傳統(tǒng)檢測方法相比，本論文所建立的傳感器對目標(biāo)物的檢測具有靈敏度高、選擇性好、成本低和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)初步驗(yàn)證了傳感器的實(shí)用性。其主要內(nèi)容如下:
　　在第二章中構(gòu)建了一種基于水溶性聚噻吩衍生物和非標(biāo)記功能核酸的光學(xué)傳感器，可以簡單快速、高靈敏地和高選擇性地檢測水溶液中的鉛離子。該傳感器檢測原理是利用鉛離子誘導(dǎo)富含G堿基的核酸DNA的結(jié)構(gòu)從自由卷曲狀態(tài)到G-四鏈

3、體狀態(tài)，同時(shí)使用陽離子水溶性聚噻吩(PMNT)作為信號產(chǎn)生單元來產(chǎn)生光學(xué)信號。通過使用特定的核酸序列TBAA（5'-GGAAGGTGTGGAAGG-3'），實(shí)現(xiàn)了對鉛離子的特異性識別，避免了傳統(tǒng)功能核酸傳感器使用掩蔽劑(CN-，SCN-)用于消除汞離子的干擾所帶來的問題。當(dāng)溶液中不存在鉛離子時(shí)，PMNT與DNA探針通過靜電相互作用，形成類雙鏈的剛性復(fù)合物，使得PMNT骨架的共軛程度增大，溶液顯現(xiàn)紅色。當(dāng)溶液中存在鉛離子時(shí)，鉛離子會(huì)誘導(dǎo)D

4、NA探針折疊成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，PMNT通過靜電作用纏繞在G-四鏈體表面形成復(fù)合物，在該復(fù)合物中PMNT的共軛程度低，溶液顏色為黃色?；谝陨显?，本傳感器實(shí)現(xiàn)了對鉛離子的高靈敏和特異性檢測。本傳感器可以在5分鐘內(nèi)快速的檢測水溶液中微摩爾濃度的鉛離子，利用熒光檢測方法可以把檢測限提高到納摩爾級別。該傳感器成功的被應(yīng)用到自來水中鉛離子的檢測。
　　在第三章中基于氧化石墨烯對單鏈DNA和G-四鏈體DNA的吸附能力不同，設(shè)計(jì)了一種熒光增強(qiáng)

5、型的G-四鏈體傳感器用于鉛離子的檢測。通過使用在第二章中篩選出的核酸序列TBAA作為探針，實(shí)現(xiàn)了對鉛離子特異性的識別。首先在探針的5'末端修飾上熒光發(fā)色團(tuán)，不存在鉛離子時(shí)，核酸探針在溶液中呈現(xiàn)柔軟的單鏈構(gòu)象。加入氧化石墨烯，通過單鏈核酸的堿基與氧化石墨烯的芳香性六元環(huán)π-π堆積作用，單鏈核酸探針吸附在氧化石墨烯表面導(dǎo)致熒光發(fā)色團(tuán)的熒光猝滅。當(dāng)存在鉛離子時(shí)，鉛離子誘導(dǎo)TBAA從單鏈構(gòu)象折疊成G-四鏈體構(gòu)象。加入氧化石墨烯，因?yàn)镚-四鏈體與

6、氧化石墨烯的作用力比較弱，帶有熒光發(fā)色團(tuán)的G-四鏈體遠(yuǎn)離氧化石墨烯的表面使熒光發(fā)色團(tuán)的熒光不被猝滅。該傳感器對鉛離子的最低檢測限為400pM，同時(shí)該傳感器被成功的應(yīng)用到河水和自來水中鉛離子的檢測。
　　在第四章中利用氧化石墨烯對單、雙鏈DNA的吸附能力不同，設(shè)計(jì)了一個(gè)基于氧化石墨烯的生物傳感器用于HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H的活性檢測及抑制劑篩選。首先在DNA序列的3'末端修飾上熒光發(fā)色團(tuán)，然后與該序列互補(bǔ)的RNA雜交形成DN

7、A/RNA雜交體。不存在RNase H時(shí)，因?yàn)镈NA/RNA與氧化石墨烯的相互作用比較弱，加入氧化石墨烯后DNA/RNA不能穩(wěn)定的吸附在氧化石墨烯的表面，因此熒光發(fā)色團(tuán)的熒光不會(huì)被猝滅。當(dāng)存在RNase H時(shí)，RNase H能夠催化DNA/RNA中的RNA裂解成核糖核苷片段從而釋放出單鏈DNA。加入氧化石墨烯后，單鏈DNA能夠強(qiáng)力的吸附在氧化石墨烯的表面導(dǎo)致熒光猝滅。當(dāng)存在酶抑制劑時(shí)，RNaseH的酶活性被抑制，RNA/DNA依舊保持雙

8、鏈的狀態(tài)。加入氧化石墨烯后熒光不被猝滅。該傳感器對HIV-1 RNase H酶的最低檢測限為0.6units mL-1，同時(shí)可以進(jìn)行高通量篩選HIV-1 RNase H酶抑制劑。本傳感器不僅提供了一個(gè)檢測HIV-1 RNase H酶活性和抑制劑篩選的通用平臺(tái)，也在抗艾滋病藥物的研發(fā)以及臨床治療方面表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　在第五章中發(fā)展了一種新型的基于核酸切刻酶輔助目標(biāo)循環(huán)放大的分子適配體信標(biāo)策略用于ATP高靈敏的檢測。切刻酶是

9、一種限制性核酸內(nèi)切酶，可特異性地識別雙鏈DNA中的核苷酸序列，并對其中的一條鏈進(jìn)行切割。在本實(shí)驗(yàn)中使用的切刻內(nèi)切酶是Nt.CviPII，能夠特異性的在5'-…↓CCA…-3'位點(diǎn)處切刻雙鏈DNA。在該傳感策略中，把ATP的核酸適配體分割成兩個(gè)短鏈寡聚核苷酸，Apt1和Apt2。其中Apt1的3'端修飾了熒光發(fā)色團(tuán)。Apt1可以通過分子內(nèi)自組裝的方式形成分子信標(biāo)。Apt1環(huán)狀部分可以和Apt2一同作為ATP的適配體。不存在ATP時(shí)，因?yàn)楹?/p>

10、有錯(cuò)配的堿基對，Apt2不能夠與Apt1中的環(huán)狀部位雜交。因?yàn)锳pt1和Apt2含有大的單鏈結(jié)構(gòu)，加入氧化石墨烯后，通過單鏈DNA的堿基與氧化石墨烯的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)之間的π-π堆積作用，Apt1和Apt2吸附在氧化石墨烯的表面導(dǎo)致Apt1的熒光猝滅。當(dāng)存在ATP時(shí)，Apt2和ATP一起作用于Apt1的環(huán)狀部位打開Apt1的發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成雙鏈DNA。在這個(gè)雙鏈DNA結(jié)構(gòu)中含有核酸切刻酶Nt.CviPII的切割位點(diǎn)。加入Nt.CviPII后，可以

11、把雙鏈DNA中的Apt1切割成兩部分，從而使APT和Apt2游離出來。游離出來的APT和Apt2又可以對另外一分子的Apt1分子信標(biāo)進(jìn)行互補(bǔ)配對，然后再次被酶切割，從而進(jìn)行循環(huán)，累積許多含有熒光基團(tuán)的短鏈DNA。因?yàn)楸幻盖懈詈驛pt1是兩條短鏈DNA，其與氧化石墨烯的相互作用能力比較弱，從而遠(yuǎn)離氧化石墨烯的表面產(chǎn)生熒光信號，并經(jīng)過多次循環(huán)后實(shí)現(xiàn)了信號放大效應(yīng)。該方法實(shí)現(xiàn)了對ATP的高靈敏和高特異性檢測，響應(yīng)動(dòng)態(tài)范圍為10nM到1000n