地衣芽孢桿菌CGMCC2876生物絮凝劑的合成代謝途徑及其基因調(diào)控研究.pdf

1、石油危機(jī)和高分子材料難降解等問題突顯，環(huán)境友好型高分子材料的開發(fā)與應(yīng)用引起了極大的關(guān)注。生物絮凝劑因其無毒、能自然降解等特性在水處理領(lǐng)域倍受青睞。目前已經(jīng)篩選并鑒定的生物絮凝劑產(chǎn)生菌株眾多，但其代謝途徑和相關(guān)分子水平的研究還鮮有報(bào)道。
　　 本研究從多糖絮凝劑產(chǎn)生菌地衣芽孢桿菌CGMCC2876出發(fā)，改變其培養(yǎng)條件，合成出形態(tài)和性質(zhì)都異于多糖的生物絮凝劑，通過紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、高效液相色譜以及核磁分析，鑒定出該生物絮凝劑

2、由94.43％γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、3.92％多糖和1.65％蛋白質(zhì)組成。
　　 首先，對實(shí)驗(yàn)菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳培養(yǎng)基組成(gL-1):檸檬酸三鈉20，甘油20，NH4Cl9，谷氨酸鈉10，MgSO4·7H2O0.5，K2HPO40.5，pH7.2;最佳培養(yǎng)條件:200 rpm，37℃搖瓶培養(yǎng)20 h。此時(shí)，絮凝活性達(dá)到11670U mL-1，產(chǎn)量為21.8 gL-1。同時(shí)，該生物絮凝劑具有良好的pH和熱穩(wěn)定

3、性，與常用的化學(xué)絮凝劑聚丙烯酰胺相比，在制糖工業(yè)澄清工段中脫色效果相當(dāng)，除濁能力更強(qiáng)。
　　 其次，考察培養(yǎng)基成分對實(shí)驗(yàn)菌株合成的γ-PGA分子結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明:實(shí)驗(yàn)菌株為兼性谷氨酸依賴型，當(dāng)不添加谷氨酸鈉時(shí)，γ-PGA由62.22％D-谷氨酸(D-Glu)單體組成，反之，由37.09％D-Glu組成;γ-PGA的分子量主要有三種:2.0×106 Da、6.0×105 Da和2.0×105 Da，三者含量與檸檬酸三鈉的濃度有

4、關(guān)。同時(shí)，γ-PGA的產(chǎn)量、D-Glu的含量及2.0×105 Da含量與其絮凝活性呈正相關(guān)性，6.0×105 Da和L-Glu的含量則呈反相關(guān)性。
　　 隨后，克隆了實(shí)驗(yàn)菌株中γ-PGA合成酶基因—pgsBCA，該基因由3個(gè)開放閱讀框架組成，大小為2974bp，與B.licheniformis WBL-3中pgsBCA基因的相似度為98％。在E.coli JM109細(xì)胞外不僅可以合成γ-PGA而且有較高的絮凝活性。利用數(shù)據(jù)庫對γ

5、-PGA合成酶復(fù)合物(PgsBCA)進(jìn)行定位并分析其3-D結(jié)構(gòu)、生化性質(zhì)和功能，探索其相互作用機(jī)制:PgsB參與γ-PGA的延伸，PgsA可被Mg2+激活將γ-PGA從結(jié)合位點(diǎn)脫離，與PgsC將產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)桨狻?br>　　 同時(shí)，對課題組篩選獲得的陽性多糖絮凝劑克隆子的插入片段進(jìn)行注釋，大小為29.6 kb，由26個(gè)開放閱讀框架組成，分析其所編蛋白質(zhì)的生化性質(zhì)、功能及參與的代謝途徑。確定了實(shí)驗(yàn)菌株合成多糖絮凝劑的關(guān)鍵基因:糖基磷酸轉(zhuǎn)移

6、酶基因（bli2）、糖基轉(zhuǎn)移酶基因(bli16)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(bli9、bli10和bli11和多糖絮凝劑降解的基因(bli1)，以及兩個(gè)基因簇(bli7～11和bli16～18)，并構(gòu)建了實(shí)驗(yàn)菌株合成多糖絮凝劑的代謝途徑。
　　 最后，采用基因敲除的方法，考察了pgsBCA基因?qū)?shí)驗(yàn)菌株合成生物絮凝劑的影響。利用重疊PCR技術(shù)成功構(gòu)建pgsBCA基因敲除質(zhì)粒并導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)菌株中，但pgsBCA基因缺失菌株的篩選還在進(jìn)行。為