近紅外硅基羅丹明——合成方法學(xué)及熒光探針的構(gòu)建與成像研究.pdf

1、近年來，熒光成像技術(shù)為人們研究活體細胞及組織內(nèi)的化學(xué)生物學(xué)過程提供了有效的研究工具，可以無損、實時、原位地以高時空分辨率實現(xiàn)對目標物進行生物熒光成像與分析。熒光成像技術(shù)在生物學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、臨床診斷和藥物發(fā)現(xiàn)等諸多研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。生物熒光成像技術(shù)的最新進展對發(fā)展新型小分子熒光染料及探針提出了更高的要求。激發(fā)和發(fā)射波長位于近紅外光區(qū)(600-900 nm)的熒光染料及探針由于具有光毒性低、生物分子自發(fā)熒光干擾小、光散射低、組

2、織穿透能力強等優(yōu)點，非常適合用于生物熒光成像領(lǐng)域。
　　研究表明，通過將羅丹明分子中O橋原子用SiMe2代替，得到了硅基羅丹明熒光染料。這類染料分子在保留了羅丹明熒光染料優(yōu)越的光學(xué)性質(zhì)的同時，光譜發(fā)生明顯紅移，滿足了近紅外熒光檢測的要求，具有良好的生物相容性。在本論文中，我們致力于構(gòu)建基于硅基羅丹明的近紅外熒光成像平臺。
　　一、硅基羅丹明染料合成方法學(xué)研究
　　現(xiàn)有硅基羅丹明染料的合成方法操作復(fù)雜，產(chǎn)率較低，且底物選

3、擇范圍有限，大大限制了硅基羅丹明熒光探針的發(fā)展。為了解決這一問題，我們進行了硅基羅丹明合成方法學(xué)的研究工作，開發(fā)了一條全新的硅基羅丹明合成路線。通過二芳基硅醚中間體與取代苯甲醛反應(yīng)，構(gòu)建硅基羅丹明母核。通過該合成方法，我們大大擴充了硅基羅丹明染料的種類，合成了擴環(huán)的和具有不對稱結(jié)構(gòu)的硅基羅丹明衍生物，并且成功構(gòu)建了含有以前方法難以引入基團（如-Br，-NO2等）的硅基羅丹明衍生物。在此基礎(chǔ)上，通過Click反應(yīng)，將細胞線粒體靶向基團引入

4、到含炔基的硅基羅丹明分子中，合成出具有線粒體靶向功能的近紅外熒光探針，并成功應(yīng)用于活細胞線粒體的熒光成像實驗中。
　　二、功能化硅基羅丹明近紅外熒光探針的構(gòu)建及成像研究
　　在合成方法學(xué)研究的基礎(chǔ)上，我們進一步設(shè)計并合成了功能化硅基羅丹明近紅外熒光探針，并應(yīng)用于活細胞近紅外熒光成像研究中。一方面，硅基羅丹明的螺環(huán)化已被證實是一種有效的設(shè)計“關(guān)-開”型熒光探針的手段，具有熒光背景低和檢測靈敏度高等優(yōu)點。另一方面，在對硅基羅丹明

5、的性質(zhì)進行研究過程中我們發(fā)現(xiàn)，相較于具有類似結(jié)構(gòu)的羅丹明分子，硅基羅丹明有著許多獨特的性質(zhì)，其中較為突出的一點是硅基羅丹明分子中的螺環(huán)具有特殊的穩(wěn)定性，特別是對H+有很強的耐受性。這使得硅基羅丹明在正常生理條件下和酸性環(huán)境中都有極低的熒光背景。因此，含有螺環(huán)結(jié)構(gòu)的硅基羅丹明分子能夠以較高的信噪比實現(xiàn)酸性條件下不同分析物的近紅外熒光成像。
　　由于溶酶體的酸性環(huán)境，往往會使一般的熒光探針產(chǎn)生背景熒光或者影響探針分子對檢測物的響應(yīng)，使

6、得檢測靈敏度降低，因而能夠用于對細胞溶酶體中分析物進行生物成像的小分子熒光探針少之又少。得益于硅基羅丹明分子中螺環(huán)特殊的穩(wěn)定性，我們設(shè)計并合成了具有溶酶體靶向功能的硅基羅丹明Cu2+探針SiRB-Cu和硅基羅丹明NO探針Lyso-SiRB-NO，分別對其光譜學(xué)性質(zhì)進行了研究，并成功應(yīng)用于活細胞溶酶體內(nèi)Cu2+和NO的近紅外熒光成像實驗中。
　　1、含六元螺環(huán)的硅基羅丹明靶向溶酶體Cu2+近紅外熒光探針
　　細胞溶酶體Cu2+

7、平衡的調(diào)節(jié)與許多生理和病理過程著密切的聯(lián)系，開發(fā)一種能夠檢測細胞溶酶體內(nèi)Cu2+實時分布和濃度變化的熒光探針具有重要的研究價值。我們報道了一個含有六元胺基硫脲螺環(huán)的硅基羅丹明Cu2+探針——SiRB-Cu，胺基硫脲結(jié)構(gòu)不僅僅是Cu2+的結(jié)合和反應(yīng)位點，同時與可以起到溶酶體靶向的功能;螺環(huán)的穩(wěn)定性大大降低了探針SiRB-Cu在溶酶體中的檢測背景，提高了檢測靈敏度。探針SiRB-Cu實現(xiàn)了活細胞溶酶體內(nèi)外源性和內(nèi)源性Cu2+的近紅外熒光成像

8、。
　　2、具有溶酶體靶向功能的硅基羅丹明NO近紅外熒光探針
　　作為一種重要的信使分子，NO在溶酶體中的作用與許多病理生理過程有關(guān)。利用鄰苯二胺基團作為NO的反應(yīng)識別位點，我們合成得到了基于螺環(huán)開環(huán)原理的硅基羅丹明NO探針SiRB-NO;通過偶聯(lián)反應(yīng)引入嗎啉結(jié)構(gòu)，作為溶酶體靶向基團，合成得到具有溶酶體靶向功能的NO近紅外熒光探針Lyso-SiRB-NO。探針Lyso-SiRB-NO具有一系列H+相關(guān)的性質(zhì):對H+較強的耐受

9、性、H+能夠促進探針對NO的識別、H+能夠抑制熒光產(chǎn)物的水解、H+能夠使水解產(chǎn)物L(fēng)yso-SiRB的熒光增強等。探針Lyso-SiRB-NO以極低的熒光背景、較高的靈敏度、較好的選擇性和較好的時空分辨率分別實現(xiàn)了細胞溶酶體內(nèi)NO的近紅外熒光成像。
　　與具有相應(yīng)結(jié)構(gòu)的羅丹明探針相比，硅基羅丹明探針SiRB-Cu和Lyso-SiRB-NO在細胞溶酶體成像中的成功應(yīng)用，證明了硅基羅丹明分子中螺環(huán)的特殊性質(zhì)可以成功的用于功能化近紅外熒光