基于PDMAEMA修飾的不同形貌納米顆粒構(gòu)建高性能基因載體.pdf

1、基因治療是指使用功能性的治療基因替換有缺陷或補(bǔ)充缺失的基因，或者通過抑制某些基因的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的行為，從而達(dá)到治療效果。在往靶細(xì)胞傳遞基因的過程中核酸很容易被破壞或降解，因此基因治療的關(guān)鍵是需要一個(gè)有效的傳遞系統(tǒng)能夠?qū)⒑怂崴幬锇踩膫鬟f到靶細(xì)胞當(dāng)中。病毒可以有效地將自身的遺傳信息傳遞到宿主細(xì)胞中，但是病毒作為載體缺乏對細(xì)胞的特異性識別、生產(chǎn)成本高、存在免疫原性和致突變性等安全問題。而非病毒載體穩(wěn)定性好，可以長期存儲(chǔ)，可以運(yùn)載更長的基因

2、片段，并且非病毒基因載體的物化性質(zhì)可以通過不同的合成方法和化學(xué)修飾來調(diào)控，在構(gòu)建基因載體時(shí)更加靈活。然而，不同于病毒載體的作用機(jī)制，非病毒載體在轉(zhuǎn)染過程中需要克服細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的多層屏障，例如跨越細(xì)胞膜、內(nèi)涵體逃逸等過程，才能最終將所攜帶的核酸運(yùn)載到目的地。
　　陽離子聚合物甲基丙烯酸N，N-二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)可以與DNA通過靜電相互作用形成納米顆粒，保護(hù)DNA免受核酸酶的降解。但較高分子量的PDMAEMA表現(xiàn)出良好

3、轉(zhuǎn)染性能的同時(shí)也表現(xiàn)出了較高的細(xì)胞毒性。另有報(bào)道稱，相對于球形納米顆粒，具有特殊形貌的納米顆粒更易于被細(xì)胞所攝取，而細(xì)胞對納米載體的內(nèi)化效率會(huì)直接影響到最終載體的轉(zhuǎn)染性能。因此，我們結(jié)合活性可控聚合，并針對在基因治療中的關(guān)鍵問題和發(fā)展趨勢，使用小分子量的PDMAEMA修飾不同形貌納米顆粒，構(gòu)建了一系列功能化的高效基因載體。
　　水滑石(LDH)是一種片層狀的納米顆粒，層與層之間可以通過離子交換插入陰離子藥物，從而作為藥物或基因載體

4、。但是，目前基于LDH所設(shè)計(jì)的基因載體轉(zhuǎn)染效率都比較低。雙硫鍵具有還原響應(yīng)性，可以細(xì)胞內(nèi)還原性物質(zhì)所打斷，例如谷胱甘肽。由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量遠(yuǎn)高于細(xì)胞外環(huán)境和正常組織細(xì)胞，故在基因載體中引入雙硫鍵可以實(shí)現(xiàn)載體在運(yùn)輸過程中保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而在腫瘤組織中快速瓦解，釋放所攜帶的核酸藥物。我們首先利用LDH表面的羥基在其表面引入含有雙硫鍵的ATRP引發(fā)位點(diǎn)，然后使用表面引發(fā)ATRP的方法在LDH表面接枝PDMAEMA陽離子聚合物鏈，制備了一

5、系列以片層狀結(jié)構(gòu)的LDH為基體、不同分子量PDMAEMA為聚合物側(cè)鏈，并具有還原響應(yīng)性的基因載體(LDH-PDs)。我們對LDH-PDs的形貌、攜帶DNA能力、細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率等方面進(jìn)行了研究與討論。結(jié)果表明，與線性PDMAEMA和“國際金標(biāo)”PEI相比，這種基于片層狀LDH的基因載體顯示出了更高的細(xì)胞內(nèi)化率和轉(zhuǎn)染效率;在最佳氮磷比時(shí)，所制備的LDH-PDs基因載體在不同細(xì)胞中表現(xiàn)出的轉(zhuǎn)染效率是PEI的3-9倍。
　　納米纖維素

6、(CNC)屬于聚多糖納米晶，具有獨(dú)特的針狀結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性。我們基于PDMAEMA修飾LDH制備基因載體的研究，通過對針狀CNC表面修飾，在其表面通過雙硫鍵連接PDMAEMA聚合物鏈，構(gòu)建了一系列基于CNC的基因載體(CNC-S S-PDs)。我們對CNC-SS-PDs與DNA結(jié)合的能力、還原響應(yīng)性、細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率和體外、體內(nèi)抗腫瘤能力等進(jìn)行了測試和表征。研究表明，CNC-SS-PDs具有高效的基因轉(zhuǎn)染能力和較低的細(xì)胞毒性。同

7、時(shí)CNC獨(dú)特的針狀形貌對細(xì)胞的內(nèi)吞有著顯著的促進(jìn)作用。通過自殺基因前藥系統(tǒng)（CD自殺基因/5-氟胞嘧啶）的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CNC-SS-PDs能有效將CD自殺基因傳遞到腫瘤細(xì)胞中。在CD自殺基因表達(dá)的胞嘧啶脫氨酶的作用下，前藥5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變成為可以殺死細(xì)胞的5-氟尿嘧啶，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡，抑制腫瘤的生長。
　　基于對PDMAEMA修飾的CNC作為基因載體的研究，我們通過進(jìn)一步改性，在降低載體毒性同時(shí)賦予載體成像功能。我

8、們制備了一種可以分別引發(fā)ATRP和RAFT聚合的雙功能引發(fā)劑，在CNC表面除了通過ATRP引入PDMAEMA鏈外，還使用RAFT聚合在CNC表面引入了聚（聚乙二醇乙醚）甲基丙烯酸酯(PEGEEMA)來降低載體毒性和提高載體的穩(wěn)定性。此外，成像在臨床診療過程中扮演著不可或缺的角色。許多研究都致力于將成像功能和基因治療結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)在基因治療的同時(shí)對治療過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測。金納米顆粒(Au NPs)生物相容性好，比碘基的CT造影劑有更好的造影

9、效果。我們利用PDMAEMA側(cè)鏈上豐富的氨基作為固定位點(diǎn)將Au NPs固定在基于CNC的基因載體表面。通過測試發(fā)現(xiàn)，表面修飾PEGEEMA和PDMAEMA側(cè)鏈的CNC載體(CNC-g-PPEG/PDMA)具有優(yōu)異的轉(zhuǎn)染性能，在最佳氮磷比時(shí)，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)PEI的10倍。載體表面引入Au NPs后(CNC-g-PPEG/PDMA@Au)，載體被賦予CT造影功能的同時(shí)，依然表現(xiàn)出與PEI相媲美的轉(zhuǎn)染效率。
　　綜上所述，我們使用PDMA