Nesfatin-1在雄性大鼠生殖軸上的表達(dá)與作用.pdf

1、目的：
　　探討Nesfatin-1/NUCB2在雄性大鼠下丘腦-垂體-睪丸軸上的表達(dá)和作用。分析Nesfatin-1/NUCB2蛋白及其mRNA在不同發(fā)育階段雄性大鼠生殖軸和血清中的表達(dá)變化。結(jié)合外源性Nesfatin-1/NUCB2對(duì)促性腺激素、性腺激素的分泌及其相關(guān)基因表達(dá)的影響以及對(duì)體外培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮及其合成相關(guān)基因的影響。在組織學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、細(xì)胞和分子水平闡明Nesfatin-1/NUCB2在雄性大鼠生殖軸的表

2、達(dá)及其作用制。
　　方法：
　?。?）10d，25d，45d雄性大鼠心臟灌注后取下丘腦、垂體和睪丸，經(jīng)過(guò)4％多聚甲醛固定后，制做石蠟切片，采用免疫熒光法觀察Nesfatin-1/NUCB2的定位，并用形態(tài)學(xué)分析軟件統(tǒng)計(jì)平均熒光強(qiáng)度。
　?。?）取不同發(fā)育階段（10d，25d，45d，65d）雄性SD大鼠血液、下丘腦、垂體和睪丸，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（quantificational real-time poly

3、merase chain reaction，qRT-PCR）和酶聯(lián)免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)分析Nesfatin-1/NUCB2 mRNA在下丘腦、垂體和睪丸上的表達(dá)及血清中Nesfatin-1濃度的變化。
　?。?）45d，65d雄性大鼠麻醉后固定于腦立體定位儀，試驗(yàn)組和對(duì)照組分別側(cè)腦室注射10μL的Nesfatin-1/NUCB2（含50 ng）和生理鹽水，60

4、 min后斷頭處死，取血液、下丘腦、垂體和睪丸，ELISA檢測(cè)血清中促黃體素（luteinizing hormone，LH）、促卵泡素（follicle-stimulate hormone，F(xiàn)SH）和睪酮(Testosterone，T)的濃度；qRT-PCR檢測(cè)下丘腦GnRH和Kiss-1、垂體FSHβ和LHβ、睪丸3β-HSD、17β-HSD、P450scc和StAR mRNAs的表達(dá)水平。
　　（4）45d雄性大鼠斷頭處死，收

5、集睪丸間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，單獨(dú)添加不同劑量的Nesfatin-1/NUCB2以及共添加Nesfatin-1/NUCB2和hCG，48h后收集培養(yǎng)液和細(xì)胞，ELISA測(cè)培養(yǎng)液中T的濃度，qRT-PCR分析細(xì)胞中3β-HSD、17β-HSD、P450scc和StAR mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　?。?）Nesfatin-1/NUCB2在10d，25d，45d雄性大鼠的正中隆起、室旁核、弓狀核、室周核、視上核、下丘腦外側(cè)

6、區(qū)，腺垂體以及睪丸間質(zhì)細(xì)胞上均有分布。但在45d大鼠下丘腦正中隆起和弓狀核，免疫熒光強(qiáng)度顯著高于10d和25d（P<0.05）；在10d大鼠的室旁核、室周核和下丘腦外側(cè)區(qū)，免疫熒光強(qiáng)度顯著低于25d和45d（P<0.05），而25d和45d則差異不顯著（P>0.05）；在下丘腦視上核、腺垂體和睪丸間質(zhì)細(xì)胞，免疫熒光強(qiáng)度隨年齡增加(從10d到45d)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)（P<0.05）。
　?。?）Nesfatin-1/NUCB2 m

7、RNA在10d，25d，45d，65d的雄性大鼠下丘腦、垂體、睪丸中均有表達(dá)；在下丘腦，45d大鼠Nesfatin-1/NUCB2mRNA表達(dá)水平顯著低于10d（P<0.05）；在垂體和睪丸，45d和65d的表達(dá)水平顯著高于10d和25d（P<0.05）。大鼠血清中Nesfatin-1/NUCB2的濃度在25d顯著低于10d、45d和65d（P<0.05）。
　?。?）側(cè)腦室注射N(xiāo)esfatin-1/NUCB2顯著降低雄性大鼠血清

8、中FSH、LH和T的含量（P<0.05）；下丘腦的GnRH、Kiss-1、垂體FSHβ、LHβ和睪丸StAR mRNAs的水平都顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；Nesfatin-1顯著提高65d但降低45d大鼠睪丸3β-HSD、17β-HSD、P450scc mRNAs的表達(dá)（P<0.05）。
　　（4）在體外，1ng/ml Nesfatin-1/NUCB2顯著提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞T的分泌和GnRH、Kiss-1、FSHβ、LHβ3β

9、-HSD、17β-HSD、P450scc、StAR mRNAs的表達(dá)（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　（1）Nesfatin-1/NUCB2蛋白及其mRNA廣泛存在于雄性大鼠下丘腦、垂體和睪丸，但其表達(dá)水平隨年齡不同而有差異。
　　（2）Nesfatin-1在25d大鼠血清中濃度最低。
　?。?）Nesfatin-1/NUCB2在中樞水平抑制45d和65d雄性大鼠促性腺激素和睪酮的分泌以及下丘腦的GnRH、Ki