基于納米結(jié)構(gòu)氧化鋅的電化學(xué)生物傳感研究.pdf

1、生物傳感器是在化學(xué)傳感器的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一個(gè)非常活躍的研究領(lǐng)域，它與生物信息學(xué)、生物芯片、生物控制論、仿生學(xué)、生物計(jì)算機(jī)等學(xué)科一起，處在生命科學(xué)和信息科學(xué)的交叉區(qū)域。它利用生物活性物質(zhì)的親和性，如酶-底物、酶-輔基、抗原-抗體、激素-受體等的分子識(shí)別功能，可以有選擇地檢測(cè)待測(cè)物，將生物活性物質(zhì)與各種固態(tài)物理傳感器相結(jié)合而形成的一種檢測(cè)儀器，具有靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好和進(jìn)行快速在線連續(xù)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)，能廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、生

2、物、臨床化學(xué)和診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品分析、過(guò)程控制與檢測(cè)等領(lǐng)域。無(wú)論是對(duì)生物電子體系的機(jī)理研究，還是實(shí)際應(yīng)用開(kāi)發(fā)，生物傳感器都激發(fā)了各國(guó)研究者廣泛而持久的興趣。
　　 構(gòu)建生物傳感器有兩個(gè)核心問(wèn)題，一是生物分子的固定化，二是生物分子活性的保持。這對(duì)固定生物分子的載體材料提出了很高的要求。
　　 納米尺度的ZnO具有較好的電子傳導(dǎo)能力，具有高等電點(diǎn)（IEP=9.5），與蛋白質(zhì)或者生物細(xì)胞等生物材料有極好的兼容性，安全無(wú)毒，很

3、適合用來(lái)吸附低等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。這些優(yōu)點(diǎn)是其他納米材料所無(wú)法比擬的，完全符合構(gòu)建生物傳感器對(duì)載體材料的特殊要求，使其在生物化學(xué)傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用上具有很強(qiáng)的吸引力。
　　 本論文以建立納米結(jié)構(gòu)氧化鋅在生物傳感器方面的應(yīng)用體系為目標(biāo)，將氧化鋅納米材料優(yōu)異的特性應(yīng)用于生物傳感器中。這一體系包括納米結(jié)構(gòu)氧化鋅的制備、生物分子在納米結(jié)構(gòu)氧化鋅表面的組裝、電極的修飾、電化學(xué)及光學(xué)傳感特性測(cè)試等研究。具體闡述如下：
　　 一、目前合成Z

4、nO一維納米材料的方法很多，包括氣相傳輸法、金屬有機(jī)氣相外延生長(zhǎng)、水熱合成法和電化學(xué)沉積法。其中氣相傳輸法和水熱法是兩種廣泛使用的方法，氣相傳輸法在不同條件下可合成多種形貌的納米結(jié)構(gòu)氧化鋅，而水熱法更有利于得到形貌均一的一維或零維氧化鋅納米結(jié)構(gòu)，如氧化鋅納米棒和氧化鋅量子點(diǎn)。
　　 明白納米ZnO的生長(zhǎng)機(jī)制，有效控制其生長(zhǎng)過(guò)程，進(jìn)而獲得理想的ZnO納米結(jié)構(gòu)作為一個(gè)重大課題，目前仍面臨許多難題和挑戰(zhàn)。因此，尋找一種穩(wěn)定生長(zhǎng)ZnO納

5、米線的條件是必要的，本章主要研究氣相傳輸法和水熱法控制生長(zhǎng)氧化鋅納米棒與氧化鋅量子點(diǎn)及其性質(zhì)。
　　 二、酪氨酸酶（Tyrosinase）是一種含銅的金屬酶，廣泛分布于微生物、動(dòng)植物及人體中。酪氨酸酶主要參與兩個(gè)反應(yīng)過(guò)程：催化L2酪氨酸羥基化轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)2多巴和氧化L2多巴形成多巴醌，多巴醌經(jīng)一系列反應(yīng)后，形成黑色素。酪氨酸酶在生物體中具有重要的生理功能。酪氨酸酶的活性中心是由兩個(gè)含銅離子位點(diǎn)構(gòu)成。在催化過(guò)程中，雙核銅離子位點(diǎn)以3種

6、形態(tài)存在，分別是氧化態(tài)、還原態(tài)和脫氧態(tài)。
　　 酪氨酸酶可以催化單酚和二酚形成的醌類化合物在水溶液中不穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)一系列催化反應(yīng)，可自身聚合或與其它物質(zhì)（有機(jī)胺類化合物等）聚合反應(yīng)形成不溶于水的大分子物質(zhì)而沉淀。因此酪氨酸酶不僅除去酚類物質(zhì)，還能去除其多種有機(jī)物，如有機(jī)胺、有機(jī)氯化合物等。
　　 ZnO納米棒能吸附負(fù)電性的酶，在Nafion存在時(shí)能形成穩(wěn)定的均一分布的多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出比純ZnO膜更優(yōu)異的電子傳遞性質(zhì)。

7、吸附在ZnO納米棒上的酪氨酸酶能有效保持其生物活性，對(duì)酚類化合物具有優(yōu)異的電化學(xué)響應(yīng)，可用于酚類化合物的測(cè)定，同時(shí)也為納米生物傳感器的構(gòu)建提供了新的途徑。
　　 三、對(duì)金絲電極進(jìn)行預(yù)處理，在金絲電極表面附著一層鋅-金合金，這層鋅-金合金有助于納米氧化鋅棒的成核生長(zhǎng)，使納米氧化鋅棒更牢固的生長(zhǎng)在金絲電極表面。利用工藝簡(jiǎn)單的水熱法把納米氧化鋅棒生長(zhǎng)在金絲電極表面。生長(zhǎng)的納米氧化鋅棒尺寸均一，通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）和熒光光譜（P

8、L）檢測(cè)說(shuō)明這種方法得到的納米氧化鋅棒結(jié)晶性質(zhì)良好，有利于酪氨酸酶在納米氧化鋅棒上的吸附。SEM、傅利葉紅外吸收光譜（FTIR），和電化學(xué)實(shí)驗(yàn)證明低等電點(diǎn)的酪氨酸酶能大量吸附在高等電點(diǎn)的納米氧化鋅棒上，并且吸附的酪氨酸酶能很好的保持其生物活性。利用這種方法構(gòu)建的傳感器對(duì)苯酚顯示了良好的傳感特性，其響應(yīng)時(shí)間小于5秒，靈敏度為103.08μA/mM，檢測(cè)限為0.623μM。用這種方法構(gòu)建的傳感器還具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，是性能良好的檢測(cè)苯

9、酚濃度的新穎的傳感器。
　　 四、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）是一個(gè)含有血紅素蛋白為催化中心的糖蛋白酶，血紅蛋白中包含F(xiàn)e3+/Fe2+氧化還原對(duì)。酶的分子質(zhì)量約為42000 Da。由于HRP相對(duì)簡(jiǎn)單的提純工藝和較低的成本，使HRP在傳感器研究方面有著非常重要的地位。HRP很早就被作為一個(gè)典型的酶系統(tǒng)用來(lái)研究對(duì)過(guò)氧化氫的催化的生物特性。
　　 HRP對(duì)H2O2的催化循環(huán)是分步進(jìn)行的，F(xiàn)e2+的雙電子氧化，產(chǎn)生一個(gè)過(guò)渡態(tài)的氧絡(luò)

10、合Ⅸπ雜化離子，過(guò)渡態(tài)Ⅰ（HRP-Ⅰ）和過(guò)渡態(tài)Ⅱ（HRP-Ⅱ），其中第二個(gè)過(guò)渡態(tài)是HRP-Ⅰ中的FeⅣ=O中心的單電子還原和π雜化絡(luò)離子的還原得到的。由于對(duì)HRP的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理研究的比較成熟，所以HRP已成為一個(gè)優(yōu)秀的模板酶用來(lái)研究生物催化材料的催化機(jī)理。
　　 用鋅粉為原料用簡(jiǎn)單的水熱法在處理過(guò)的金絲電極上生長(zhǎng)氧化鋅納米棒，在生長(zhǎng)在金絲電極上的氧化鋅納米棒上交替組裝負(fù)電性的聚合物聚苯乙烯磺酸鈉（PSS）和高等電點(diǎn)的HRP構(gòu)建

11、多層辣根過(guò)氧化物酶生物傳感器，用于過(guò)氧化氫濃度的測(cè)定。電化學(xué)、紫外可見(jiàn)吸收光譜（UV-vis）、ζ電位、SEM等測(cè)試結(jié)果說(shuō)明PSS和HRP被穩(wěn)定的層層組裝在氧化鋅納米棒表面，并且HRP在不使用電子媒介體的情況下很好的保持了其生物活性，對(duì)H2O2起到了良好的催化作用。多層組裝的HRP生物傳感器在探測(cè)H2O2濃度過(guò)程中表現(xiàn)出了非常好的傳感性能，具有寬的檢測(cè)范圍和低的檢測(cè)限，隨著HRP層數(shù)從一層到多層增加，傳感器的靈敏度也相應(yīng)的增加，其中單層

12、HRP的傳感器靈敏度為36.28μA/mM，已優(yōu)于利用HRP進(jìn)行H2O2探測(cè)的其他傳感器。
　　 五、Carbohydrate antigen19-9（CA19-9）是胰腺癌的首選標(biāo)志物，并且在其他癌癥的病例中也能檢測(cè)到CA19-9的存在，如結(jié)腸癌，胃癌，肝癌等，所以CA19-9被認(rèn)為是一個(gè)路易斯活性寡五糖多肽（sialylated Lea-active pentasaccharide）。目前，CA19-9在臨床上難以早期發(fā)現(xiàn)，

13、而且CA19-9所標(biāo)記的腫瘤都具有極高的死亡率，所以，研究CA19-9的免疫分析檢測(cè)方法在臨床醫(yī)學(xué)和病理研究方面都具有非常重要的意義。
　　 免疫分析法是以抗原或半抗原和抗體的特異性結(jié)合生成抗原一抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)而建立的分析方法。它的提出及發(fā)展是生物分析化學(xué)最偉大的成就之一。免疫分析法因其良好的選擇性，已廣泛應(yīng)用于臨床監(jiān)測(cè)、生化分析、毒物分析、環(huán)境分析和疾病防治等方面。估計(jì)全世界每年要進(jìn)行數(shù)億次的免疫分析。目前最為成熟

14、的免疫分析方法是放射免疫分析法，但由于放射性物質(zhì)的毒害，限制了它的應(yīng)用。為了替代放射免疫分析法，靈敏度高的非放射免疫分析法的研究成為免疫分析法的研究熱點(diǎn)。自上世紀(jì)中葉以來(lái)，已創(chuàng)立了一系列非放射免疫分析法，如包括酶聯(lián)免疫分析法、熒光免疫分析法、電化學(xué)免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。這些技術(shù)使其在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上進(jìn)行抗原和抗體的定位，對(duì)各種極微量的生物活性物質(zhì)的超微量測(cè)定等達(dá)到了一個(gè)新的水平，它們已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物

15、、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域。
　　 氧化鋅納米材料在免疫檢測(cè)上的應(yīng)用為生物分子的組裝和分析帶來(lái)了新的方向和方法。在經(jīng)過(guò)的修飾的金片或硅片等功能化的襯底上通過(guò)化學(xué)鍵合的方法連接上抗體，同時(shí)在氧化鋅量子點(diǎn)上通過(guò)靜電吸附或氫鍵等作用組裝抗體，然后用待測(cè)抗原通過(guò)生物特異反應(yīng)將量子點(diǎn)上的抗體和襯底底片上的抗體連接到一起，建立抗原分子與量子點(diǎn)之間的數(shù)量關(guān)系，將難以實(shí)現(xiàn)的對(duì)抗原的濃度檢測(cè)轉(zhuǎn)化為容易實(shí)現(xiàn)的對(duì)氧化鋅量子點(diǎn)的檢測(cè)。由于對(duì)氧化鋅的檢測(cè)方法多樣

16、而且成熟，如電化學(xué)分析法和熒光分析法等，所以利用這種過(guò)程構(gòu)建的對(duì)抗原濃度檢測(cè)的免疫傳感器可用多種方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程快速，方便，準(zhǔn)確，不需使用昂貴的儀器和繁雜的分析手段。
　　 本文利用簡(jiǎn)單的水熱法合成了粒徑均勻，分散性好的氧化鋅量子點(diǎn)。進(jìn)而利用氧化鋅量子點(diǎn)組裝CA19-9抗體，與化學(xué)鍵合在硅襯底上的CA19-9抗體通過(guò)CA19-9特異性結(jié)合，將組裝有CA19-9抗體的氧化鋅量子點(diǎn)連接到硅襯底上，將難以實(shí)現(xiàn)的對(duì)CA19-9