微生物法合成(R,R)-2，3-丁二醇的研究.pdf

1、2，3-丁二醇(2，3-butanediol)是一種潛在的大宗平臺化合物，被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、燃料等領(lǐng)域。由于分子結(jié)構(gòu)中含有兩個手性碳原子，2，3-丁二醇存在三種旋光異構(gòu)體，分別是(R,R）-，(S,S)-和meso-2，3-丁二醇。(R,R)-2，3-丁二醇不僅具有混旋型2，3-丁二醇的基本功能，而且在不對稱合成方面優(yōu)勢突出，在手性液晶材料、醫(yī)藥和農(nóng)藥中間體的合成方面具有特殊應用。本研究針對目前(R,R）-2，3-丁二醇發(fā)酵原料成

2、本過高和光學純度較低的問題，主要開展了以下工作:
　　1.本文首先使用廉價氮源豆粕粉替代酵母粉發(fā)酵生產(chǎn)(R,R)-2，3-丁二醇，對多粘類芽孢桿菌的豆粕粉同步水解發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，以獲得低成本高效的(R,R)-2，3-丁二醇生產(chǎn)技術(shù)。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計PB實驗和響應面實驗確定了多粘類芽孢桿菌的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方進行搖瓶補料發(fā)酵54 h，(R,R）-2，3-丁二醇產(chǎn)量可達68.43 g/L，光學純度

3、達98.5％，生產(chǎn)強度為1.27 g/(L·h)。為了進一步降低生產(chǎn)成本，以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，使用價格更為低廉的木薯淀粉替代蔗糖作為碳源，并進一步對木薯淀粉同步糖化發(fā)酵條件進行優(yōu)化，最終獲得的最佳培養(yǎng)基配方為:木薯淀粉125 g/L，α-淀粉酶0.2 KNU/g木薯淀粉，糖化酶3 AGU/g木薯淀粉，豆粕粉60 g/L，硫酸銨1g/L，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸氫二鈉1.05g/L，磷酸二氫鉀6 g/L，吐溫-802mL/L，乙酸鈉

4、6.09 g/L，中性蛋白酶0.52 g/L，微量元素混合液3mL/L，初始pH6.4。利用該配方進行搖瓶補料同步糖化發(fā)酵50 h，獲得的(R,R)-2，3-丁二醇濃度為71.13g/L，光學純度達98.4％，生產(chǎn)強度為1.42 g/(L·h)，這是目前有關(guān)多粘類芽孢桿菌利用低價原料發(fā)酵生產(chǎn)高光學純(R,R)-2，3-丁二醇(e.e.值＞98％)的最高產(chǎn)量。綜上，本論文研究了多粘類芽孢桿菌利用低價原料木薯淀粉同步糖化、豆粕粉同步酶解發(fā)酵

5、產(chǎn)(R,R)-2，3-丁二醇，獲得了低成本高效的(R,R)-2，3-丁二醇發(fā)酵工藝。
　　2.根據(jù)基因預測信息克隆得到(R,R)-2，3-丁二醇的關(guān)鍵合成基因，分別是α-乙酰乳酸合成酶基因(alsS)、α-乙酰乳酸脫羧酶基因(alsD)和(R,R)-2，3-丁二醇脫氫酶基因(bdh)。利用合成生物學策略構(gòu)建重組質(zhì)粒pETDuet-alsS-alsD-bdh，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，成功構(gòu)建了能夠合成高光學純(R,R)-