冷脅迫條件下小胸鱉甲p38信號轉(zhuǎn)導通路相關基因的表達及功能.pdf

1、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族在響應胞外刺激時調(diào)控細胞的響應過程。p38作為該家族的成員之一，在真核生物應激響應過程中發(fā)揮重要作用。已有研究表明MAPK通路參與了昆蟲耐寒機制的調(diào)控，本實驗室雖然對擬步甲科荒漠昆蟲小胸鱉甲（Microdera punctipennis）的低溫生理機制已有大量研究，但對于小胸鱉甲的低溫調(diào)控機制還不清楚。本文主要研究了小胸鱉甲p38信號通路

2、與響應低溫的關系，旨在說明MAPK通路是否參與了小胸鱉甲的抗凍機制。通過檢測p38信號通路相關基因的低溫表達譜發(fā)現(xiàn)該通路的大部分基因在低溫條件下（4℃）上調(diào)表達，為了進一步研究該通路的主要因子在低溫條件下的功能，選擇上調(diào)表達的p38MAPK基因作為研究對象，以小胸鱉甲cDNA為模板擴增了p38的全長序列，利用大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)，對小胸鱉甲p38蛋白（Mpp38）的抗凍功能進行研究，具體內(nèi)容及結果如下：
　　1.小胸鱉甲p38信

3、號通路相關基因低溫表達譜分析。通過檢測小胸鱉甲p38信號通路中MKKK（ASK1，MLK，TAK1，），MKK（MKK3，MKK4），MAPK（p38MAPK，MNK），下游激酶（MAPKAPK，MSK1），下游底物（RhoGDI， Tau，ATF4，ETS，Max，CREB1，p53）等基因的低溫表達譜，我們發(fā)現(xiàn)除了與腫瘤、癌癥等疾病相關的基因（TAK1，MNK，RhoGDI，Tau，ATF4，ETS， Max）不響應低溫外，大部分與

4、應激相關的基因（ASK1，MLK，MKK3，MKK4， p38MAPK，MAPKAPK2，MSK1，CREB1，p53）都響應低溫而上調(diào)表達，說明p38信號通路可能參與了小胸鱉甲應對低溫脅迫的調(diào)控機制。
　　2. Mpp38的原核表達與增強細菌抗凍性分析。構建pET28a-Mpp38表達載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導表達，獲得His-Mpp38融合蛋白。Western blot鑒定融合蛋白的正確表達。檢測確

5、認p38的磷酸化水平，說明Mpp38在細菌內(nèi)能被磷酸化。通過低溫（-10℃）處理轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的生長曲線發(fā)現(xiàn)BL21(pET28a-Mpp38)比BL21(pET28a)長得快，說明Mpp38蛋白在大腸桿菌抗凍過程中發(fā)揮作用。
　　3.利用酵母系統(tǒng)對Mpp38蛋白進行功能研究。構建pYES-Mpp38真核表達載體并轉(zhuǎn)化釀酒酵母(INVSCⅠ)，經(jīng)半乳糖誘導表達Mpp38蛋白，Western blot檢測誘導不同時間后p38的磷酸化

6、水平變化，發(fā)現(xiàn)隨著誘導時間的延長，p38的磷酸化水平越來越高，而酵母細胞的p38對應物hog1的磷酸化水平無太大差異，但誘導30h后，hog1的磷酸化水平降低，甚至完全受到抑制。由此我們推測，小胸鱉甲p38在酵母細胞的外源過表達抑制了釀酒酵母內(nèi)源hog1的磷酸化。
　　通過對低溫條件下酵母生長曲線檢測發(fā)現(xiàn)INVSCⅠ（pYES2）的生長明顯比INVSCⅠ（pYES2-Mpp38）快，說明外源Mpp38蛋白的表達影響了酵母響應低溫時

7、的正常生長?？赡苁荕pp38的過表達抑制了酵母hog1的表達，導致INVSCⅠ（pYES2-Mpp38）抗凍能力減弱。從酵母的滴板實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著低溫處理的時間的延長，INVSCⅠ（pYES2）和INVSCⅠ（pYES2-Mpp38）的菌落數(shù)越來越少，但INVSCⅠ（pYES2）的菌落數(shù)比INVSCⅠ（pYES2-Mpp38）的多，也說明了p38在酵母中的表達減弱了釀酒酵母的抗凍性，與生長曲線結果一致。
　　為了進一步驗證Mpp3

8、8對釀酒酵母抗凍的影響，我們又檢測了轉(zhuǎn)基因酵母的小分子滲透保護物質(zhì)（海藻糖、甘油、脯氨酸）以及H2O2的含量，發(fā)現(xiàn)INVSCⅠ（pYES2）藻糖、甘油、脯氨酸物質(zhì)含量都比INVSCⅠ（pYES2-Mpp38）高；說明Mpp38的表達降低了酵母響應低溫時小分子滲透保護物質(zhì)的積累。
　　為了深入了解Mpp38對酵母hog1的抑制所帶來的影響，我們檢測了酵母HOG1通路低溫相關基因的低溫表達譜。-10℃促進INVSCⅠ（pYES2）中高

9、滲透性甘油促分裂原活化蛋白激酶hog1、甘油三磷酸合成酶GPDH、海藻糖-6-磷酸合成酶TPS、水楊酸甲酯轉(zhuǎn)移酶Ole等基因的表達，卻抑制了INVSCⅠ（pYES2-Mpp38）中這些基因的表達，而對hog1上游基因PBS2（MAPKK）無影響。這些基因的表達情況與小分子物質(zhì)含量的結果一致。說明Mpp38的過表達抑制了HOG1的活性，導致低溫條件下hog1下游的基因表達受影響、小分子物質(zhì)合成減少，進而降低酵母的抗凍能力。
　　綜上

10、所述，通過檢測小胸鱉甲p38信號通路中的16個基因在低溫下的mRNA水平，確定p38MAPK信號通路參與小胸鱉甲對低溫的響應。通過大腸桿菌與酵母系統(tǒng)驗證p38MAPK基因的功能，證明在原核系統(tǒng)中，Mpp38可被大腸桿菌細胞磷酸化，并且提高了低溫下大腸桿菌細胞內(nèi)抗凍物質(zhì)的積累，從而提高了細菌的抗凍能力。在酵母表達系統(tǒng)中，p38的表達抑制了酵母內(nèi)源p38同源物hog1的磷酸化，阻斷了酵母自身的HOG1通路，導致轉(zhuǎn)基因酵母抗凍能力減弱。這一結