微生物發(fā)酵生產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的研究.pdf

1、隨著我國(guó)淀粉質(zhì)原料深加工工業(yè)的發(fā)展，工藝條件的改變，要求酶制劑工業(yè)不斷更新和完善淀粉酶的種類以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。目前，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)中的常用的淀粉酶為中溫、高溫以及堿性α-淀粉酶，其適用pH范圍一般為6.0～10.0，在酸性條件下其酶活性明顯降低，已不能滿足一些酸性條件下淀粉原料的深加工工藝的要求。因此，開(kāi)發(fā)新型耐酸性α-淀粉酶制劑便顯得愈發(fā)迫切。 本研究采用微生物分離和誘變育種技術(shù)獲得一株可產(chǎn)生耐酸性α-淀粉酶菌株；進(jìn)一步采用生

2、物化學(xué)分析方法及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)該菌株產(chǎn)酶的最適發(fā)酵條件、及其所產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)和其酶的分離提取工藝條件進(jìn)行了研究。所得研究結(jié)果如下： 1.篩選得到一株產(chǎn)量較高的黑曲霉耐酸性α-淀粉酶生產(chǎn)菌株Tx78，以其為出發(fā)菌株進(jìn)行了紫外線誘變及亞硝基胍誘變，結(jié)果得到了一株產(chǎn)酶量可達(dá)1120U/mL的高產(chǎn)突變株UNTx78-358，較出發(fā)菌提高了86.7％。而且該菌株遺傳性能穩(wěn)定，具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。 2.研究了UNTx7

3、8-358所產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)，該酶為胞外酶，其最適反應(yīng)溫度為70℃，最適反應(yīng)pH為4.0，Km值為7.89g/L，當(dāng)Ca2+濃度為7mmol/L時(shí)對(duì)該酶活性具有顯著的促進(jìn)作用；該酶具有良好的耐酸性和熱穩(wěn)定性，薄層層析表明該酶制劑水解淀粉最終產(chǎn)物為麥芽糖和葡萄糖。能夠?qū)崿F(xiàn)在酸性條件下淀粉液化和糖化的同步進(jìn)行的生產(chǎn)過(guò)程，從而簡(jiǎn)化淀粉加工工藝，節(jié)約成本。 3.確定了菌株UNTx78-358液體發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基組成為：淀

4、粉6.23g/L；蛋白胨12g/L； CaC120.287g/L，以及1‰的植酸；最適發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基pH為4.0，搖瓶裝量為100mL/300mL，接種量為10％，30℃培養(yǎng)48h后補(bǔ)料20mL繼續(xù)培養(yǎng)至96h。其產(chǎn)酶量平均達(dá)到2400U/mL以上，達(dá)到目前國(guó)內(nèi)同比先進(jìn)水平。 4.研究確定了該菌株液體發(fā)酵生產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的提取工藝條件為：發(fā)酵液體經(jīng)8層紗布(或200篩)過(guò)濾得到粗酶液，粗酶液經(jīng)調(diào)節(jié)pH=6.0，于55℃下

5、濃縮后；加入3.5倍的冷藏?zé)o水乙醇，收集沉淀于-50℃冷凍干燥即得耐酸性α-淀粉酶的粗酶粉劑，其收率達(dá)89.3％，純化倍數(shù)為2.8倍，粗酶得率達(dá)到8g/L以上。再經(jīng)二次離子交換層析純化后，SDS-PAGE電泳驗(yàn)證該酶的分子量約為74kD。通過(guò)對(duì)該酶的N-木端氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該酶的N-末端的10個(gè)氨基酸序列為L(zhǎng)eu，Ser，Ala，Ala，Glu，Thr，Arg，Thr，Gln，Ser，Ile，Tyr與文獻(xiàn)報(bào)道的A.niger所產(chǎn)

6、耐酸性α-淀粉酶的N-末端氨基酸序列一致。本研究旨在通過(guò)選育具有高產(chǎn)耐酸性-α淀粉酶能力的菌株，并通過(guò)對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)研究，以及該菌株的液體發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化和下游分離提取技術(shù)的研究。為我國(guó)耐酸性α-淀粉酶制劑的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。在此基礎(chǔ)上還將進(jìn)一步進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵工藝及下游提取工藝的研究，爭(zhēng)取早日實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)。因此，本研究的實(shí)施不僅可以填補(bǔ)我國(guó)在耐酸性淀粉水解酶類的生產(chǎn)上的空白，具有較高的學(xué)術(shù)價(jià)值，如能進(jìn)一步深入研究還可以產(chǎn)生巨大