實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HBV cccDNA體系建立及臨床應(yīng)用初步研究.pdf

1、目的：建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HBV cccDNA方法，測定重型乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA含量，并進(jìn)一步探索人工肝支持系統(tǒng)對重型乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA的影響。 方法：用不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，并檢測該方法的靈敏性及重復(fù)性；HBV DNA陽性的慢性乙型肝炎(輕度)患者血清標(biāo)本提取物經(jīng)Plasmid_SafeTM ATP_dependent DNase酶切純化后進(jìn)行實(shí)時(shí)

2、熒光定量PCR反應(yīng)，驗(yàn)證該方法的特異性。以50例重型乙型肝炎患者人工肝血漿置換治療前后PBMC作為檢測標(biāo)本，用已建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對HBV cccDNA含量進(jìn)行定量檢測。用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：成功建立了HBV cccDNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，線性范圍為1×102～2.77x109拷貝/ml。經(jīng)特異性酶切消化后慢性乙型肝炎(輕度)患者血清中未檢測到HBV cccDNA，重型乙型肝炎患

3、者PBMC中存在HBV cccDNA。在人工肝血漿置換前后PBMC中HBV cccDNA含量(中位數(shù)log10值)分別為3.73，3.54(n=50，P＞0.05)。血清總HBV DNA與PBMC中HBV cccDNA之間有較好的相關(guān)性(r=0.39，P＜0.01)。總HBV DNA水平與PT(r=0.37，P＜0.01)、ALT(r=0.29，P＜0.05)、AST(r=0.39，P＜0.01)水平呈正相關(guān)；HBV cccDNA水平與

4、PT(r=0.34，P＜0.05)、ALT(r=0.34，P＜0.05)、AST(r=0.40，P＜0.01)水平呈正相關(guān)。 結(jié)論：本研究結(jié)果顯示，所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有良好的線性范圍、靈敏度、特異性及重復(fù)性。重型乙型肝炎患者PBMC中存在HBV cccDNA。血清總HBV DNA與PBMC中HBV cccDNA呈正相關(guān)；總HBV DNA、HBV cccDNA與PT、ALT、AST呈正相關(guān)，說明總HBV DNA、HB