天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶分離純化及其性質(zhì)研究.pdf

1、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶可以催化芳香族氨基酸的合成和降解反應(yīng).本論文對(duì)大腸桿菌中的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行分離純化,并對(duì)其酶學(xué)、動(dòng)力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究.首先通過硫酸銨分級(jí)沉淀、疏水層析、離子交換層析等方法對(duì)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行分離純化,比活提高84.164倍,得率為11.24﹪.同時(shí)通過SDS-PAGE電泳測(cè)得其亞基分子量約為43000Da左右.本文采用乒乓反應(yīng)機(jī)制對(duì)兩步轉(zhuǎn)氨反應(yīng)進(jìn)行研究,得出第一步轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的米氏常數(shù)為8.28mmol·L<'-1>,第二步轉(zhuǎn)

2、氨反應(yīng)的米氏常數(shù)為14.677mmol·L<'-1>.由此可知在兩步轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中第二步轉(zhuǎn)氨反應(yīng)為限速反應(yīng).即輔酶由胺型轉(zhuǎn)為醛型為關(guān)鍵反應(yīng)步驟.因此推斷在反應(yīng)初始階段,純酶液中添加磷酸吡哆胺比添加磷酸吡哆醛能更快的促進(jìn)產(chǎn)物的生成.由實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,反應(yīng)10分鐘后,添加磷酸吡哆胺的AspAT比添加磷酸吡哆醛的AspAT產(chǎn)物生成率提高了6.667﹪,120分鐘后,提高率只有3.397﹪.本文采用聚丙烯酰胺作為包埋材料,在細(xì)胞固定化中存在五種影響因素:

3、凝膠濃度、交聯(lián)度、過硫酸銨濃度、TEMED濃度、含菌量.因此采取五因素,四水平的正交實(shí)驗(yàn),確定細(xì)胞固定化的最適條件.由正交實(shí)驗(yàn)確定大腸桿菌固定化的最適條件為:凝膠濃度為15﹪、交聯(lián)度為5﹪、過硫酸銨加入量為400 μ L、TEMED加入量為60 μ L、5﹪菌懸液加入量為2mL.同時(shí)測(cè)得固定化細(xì)胞表觀米氏常數(shù)為10.90109mmol·L<'-1>,最大反應(yīng)速度為0.061811mmol·min<'-1>.對(duì)游離細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定,